One-step decellularization of porcine uterine tissue for developing alginate-decellularized uterine ECM hydrogel for uterine tissue engineering

Resumen Técnico: Descelularización de un solo paso de tejido uterino porcino para el desarrollo de un hidrogel de alginato y matriz extracelular uterina descelularizada

Planteamiento del problema
La ingeniería de tejido uterino posee potencial para tratar la infertilidad, las anomalías congénitas y las complicaciones derivadas de las cesáreas, como las cicatrices uterinas. Sin embargo, persiste una barrera significativa en el desarrollo de biomateriales que posean simultáneamente biocompatibilidad adecuada, integridad mecánica y reproducibilidad para la fabricación de constructos 3D porosos. Si bien la matriz extracelular uterina descelularizada (dUECM) ofrece señales estructurales y bioquímicas esenciales, sufre de una baja resistencia mecánica, lo que limita su utilidad como andamio independiente. Además, los protocolos de descelularización tradicionales suelen implicar tratamientos con detergentes secuenciales y de múltiples pasos que se extienden hasta una semana. Estos procesos prolongados pueden conducir a la pérdida de componentes bioactivos cruciales, como los glicosaminoglicanos (GAG), y alterar la composición bioquímica de la ECM. Asimismo, existe una falta de estrategias reportadas para combinar la dUECM con polímeros imprimibles para crear biotintas híbridas que integren la bioactividad con la capacidad de impresión requerida para la bioimpresión 3D por extrusión.

Metodología
El estudio empleó un enfoque sistemático para desarrollar un hidrogel híbrido bioactivo para la ingeniería de tejido uterino:

1. Descelularización de un solo paso: Los tejidos uterinos porcinos fueron procesados mediante un protocolo de detergente simultáneo de un solo paso combinando 1% de Triton™ X-100 con concentraciones variables de dodecil sulfato de sodio (SDS) (0.1%, 0.5%, 1% y 1.5%) durante duraciones de 48 o 72 horas. Esto tuvo como objetivo reducir el tiempo de procesamiento mientras se equilibraba la eliminación celular y la preservación de la ECM.
2. Caracterización de la dUECM: Los tejidos descelularizados resultantes fueron evaluados rigurosamente mediante:
   • Ensayos bioquímicos: Cuantificación de ADN (para evaluar la inmunogenicidad), cuantificación de GAG (ensayo DMMB) y cuantificación de SDS residual (ensayo MBAS).
   • Histología y microscopía: Tinción de H&E, DAPI, Tricrómico de Masson y Rojo de Picrosirius (bajo luz polarizada) para evaluar la eliminación celular, la distribución de colágeno y la organización de las fibras. La microscopía electrónica de barrido (SEM) se utilizó para el análisis ultraestructural.
   • Espectroscopía: Se utilizaron espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) y Raman para evaluar la organización molecular, la integridad de la triple hélice de colágeno y la preservación de los grupos funcionales.
   • Pruebas mecánicas: Se realizaron pruebas de tracción en láminas de tejido descelularizado para determinar la resistencia a la tracción última (UTS), el módulo de Young y el alargamiento a la rotura.
3. Formulación de la tinta de hidrogel: La dUECM óptima fue digerida enzimáticamente con pepsina y mezclada con alginato de sodio (2% y 3% p/v) para crear tintas imprimibles.
4. Bioimpresión 3D y evaluación fisicoquímica: Se fabricaron constructos utilizando impresión 3D por extrusión. El estudio evaluó la imprimibilidad (fidelidad del filamento), el comportamiento de hinchazón, los perfiles de degradación (retención de masa durante 14 días) y las propiedades mecánicas (módulo de compresión) de los andamios impresos.
5. Desempeño biológico: La biocompatibilidad del hidrogel optimizado (3% Alg + 1.5% dUECM) se evaluó utilizando células miometriales uterinas humanas (hTERT-HM). Las evaluaciones incluyeron ensayos metabólicos MTT, tinción de Live/Dead y tinción inmunocitoquímica para la α-actina de músculo liso (α-SMA) durante 7 días.

Resultos clave

• Eficiencia de la descelularización: El protocolo que utilizó 1% de Triton™ X-100 y 1% de SDS durante 48 horas (T1% + S1% - 48h) fue identificado como el óptimo. Redujo el contenido de ADN a 51.3 ± 9 ng/mg (marginalmente por encima del umbral de 50 ng/mg, pero confirmado como altamente fragmentado sin bandas de alto peso molecular) mientras retenía altos niveles de GAG (54.9 ± 7.6 μg/mg). Este equilibrio preservó la integridad estructural del colágeno y las propiedades mecánicas mejor que los protocolos más agresivos (por ejemplo, 1.5% de SDS o tratamientos de 72 horas), los cuales causaron una deplexión significativa de GAG y desorganización del colágeno.
• Propiedades del hidrogel: El hidrogel de 3% Alg + 1.5% dUECM demostró una imprimibilidad adecuada, con un factor de imprimibilidad de 1.56 ± 0.20. Exhibió una hinchazón controlada (47 ± 12%) y una alta resistencia a la degradación, reteniendo el 94 ± 18% de su masa después de 14 días. Mecánicamente, el andamio mantuvo la rigidez a lo largo del tiempo, con un módulo de compresión que disminuyó de 323 kPa a 175 kPa durante 14 días, lo que indica estabilidad estructural.
• Desempeño biológico: El hidrogel optimizado aumentó significativamente la viabilidad y proliferación celular en comparación con los controles de solo alginato. Para el día 7, las células hTERT-HM en el hidrogel de 3% Alg + 1.5% dUECM mostraron un aumento del 258 ± 13% en la actividad metabólica. Los ensayos de Live/Dead confirmaron una alta viabilidad, y la inmunotinción reveló que las células adoptaron una morfología alargada, de tipo huso, con una expresión organizada de α-SMA, indicativa de un fenotipo de músculo liso preservado.

Significancia y Reivindicaciones
El artículo sostiene que el protocolo de descelularización de un solo paso desarrollado ofrece una alternativa simplificada a los métodos tradicionales de múltiples pasos, reduciendo eficazmente el tiempo de procesamiento y la exposición a reactivos, mientras preserva los componentes esenciales de la ECM. El estudio demuestra que la mezcla de dUECM con alginato crea un hidrogel híbrido que supera las limitaciones de imprimibilidad de la dECM pura y la falta de bioactividad del alginato puro.

Los autores postulan que el hidrogel de 3% Alg + 1.5% dUECM resultante proporciona una plataforma prometedora para la ingeniería de tejido uterino. Soporta la bioimpresión 3D de constructos con un fuerte desempeño mecánico y la capacidad de soportar el crecimiento, la proliferación y el mantenimiento del fenotipo de las células miometriales uterinas humanas. El trabajo sienta las bases para el desarrollo futuro de constructos uterinos biofabricados y específicos para cada paciente, abordando la necesidad crítica de biomateriales que sean tanto instructivos biológicamente como mecánicamente adecuados para la bioimpresión 3D. El estudio mantiene un alcance modesto, centrándose en la validación in vitro y la caracterización fisicoquímica, y señala que se requieren estudios adicionales para evaluar la seguridad inmunológica con respecto a los xenoantígenos (como la α-Gal) y la funcionalidad in vivo.