End-to-end plaque counting and virus titration from laboratory plate images with deep learning

Resumo Técnico: Contagem de placas e titulação viral de ponta a ponta a partir de imagens de placas de laboratório com aprendizado profundo

Declaração do Problema
Os ensaios de placas permanecem o padrão-ouro para medir a infectividade viral; no entanto, a quantificação de placas a partir de imagens de placas é tradicionalmente realizada por inspeção visual. Esse processo manual é intensivo em mão de obra, subjetivo, propenso a variabilidade entre operadores e difícil de padronizar entre diferentes analistas e laboratórios. Embora existam soluções de software anteriores (por exemplo, Plaque2.0, Viridot, macros Fiji/ImageJ), elas frequentemente dependem de condições de imageamento controladas, óptica especializada (como fluorescência ou holografia) ou ajuste laborioso de parâmetros. Essas limitações restringem sua adoção para ensaios de placas rotineiros, sem marcação, de efeito citopático (CPE), capturados como fotografias simples.

Metodologia
Os autores propõem um fluxo de trabalho assistido por computador, de ponta a ponta, para titulação viral diretamente a partir de imagens de ensaios de placas de laboratório. O pipeline integra dois modelos de aprendizado profundo derivados da família Segment Anything Model (SAM), projetados para operar sob condições de imageamento heterogêneas sem hardware especializado.

1. Segmentação de Poços (baseada em SAM2):

   • Objetivo: Detectar e localizar automaticamente poços individuais de ensaio dentro de uma imagem de placa completa, independentemente do formato da placa (6 ou 12 poços) ou condições de iluminação.
   • Modelo: Utiliza o gerador de máscaras SAM2 (especificamente o checkpoint sam2.1_hiera_base_plus) em configuração zero-shot.
   • Processo: As imagens de entrada são redimensionadas e máscaras candidatas são geradas. Uma etapa de filtragem personalizada aplica restrições geométricas (área > 100 pixels, circularidade > 0,7) para remover detecções espúrias. As máscaras validadas são mapeadas para a resolução original para determinar o layout da grade (linha/coluna), permitindo a associação com esquemas de diluição experimentais.
   • Treinamento: Nenhum ajuste fino foi aplicado; o modelo depende de pesos pré-treinados.

2. Segmentação de Placas (baseada em SAM):

   • Objetivo: Detectar e enumerar placas dentro de cada poço recortado.
   • Modelo: Usa o codificador de imagem SAM (backbone ViT-B) como extrator de características congelado, acoplado a um decodificador convolucional leve e específico para a tarefa.
   • Treinamento: Apenas os parâmetros do decodificador foram otimizados usando PyTorch Lightning, otimizador Adam e perda de entropia cruzada binária. O modelo foi treinado em um conjunto de dados misto de imagens do vírus Mayaro (MAYV), vírus Coxsackie B3 (CVB3) e vírus Vaccinia (VACV). Extensa augmentação de dados (geométrica e baseada em cor) foi empregada para melhorar a generalização.
   • Pós-processamento: Como o modelo gera mapas de probabilidade sem separação explícita de instâncias, um pipeline de pós-processamento dedicado é aplicado. Isso inclui segmentação por watershed em transformadas de distância, detecção de círculos de Hough para validação geométrica, análise de circularidade, agrupamento DBSCAN para fundir picos próximos e filtragem de ruído (descartando detecções < 10×10 pixels). Esta etapa aborda especificamente o desafio de separar placas sobrepostas.

3. Cálculo de Titulação:

   • As contagens finais de placas por poço são combinadas com dados de diluição e volume de inoculação fornecidos pelo usuário para calcular automaticamente Unidades Formadoras de Placas por mililitro (UFP/mL).

Principais Contribuições

• Arquitetura Dual Guiada por SAM: Um fluxo de trabalho inovador que combina SAM2 para localização robusta de poços e uma variante SAM ajustada finamente para segmentação de placas, reduzindo o ônus de anotação enquanto mantém a precisão.
• Plataforma Web Integrada (Titra): O pipeline está integrado a uma plataforma baseada na web (Titra) que permite análise automatizada baseada em ML, controle de qualidade rápido e gerenciamento de experimentos.
• Conjunto de Dados Curado (MAYV/CVB3): A criação e o lançamento público planejado de um conjunto de dados composto por imagens de ensaios de placas de MAYV e CVB3, capturadas sob condições rotineiras de laboratório usando fotografia de smartphone em placas de 6 e 12 poços.
• Lançamento de Código Aberto: O sistema foi projetado para ser lançado como código aberto após a aceitação do manuscrito, a fim de facilitar análises reproduzíveis e escaláveis.

Resultados
O fluxo de trabalho foi avaliado em um conjunto de dados misto, incluindo imagens privadas de MAYV/CVB3 e imagens públicas de VACV (conjunto de dados VACVPlaque).

• Detecção de Poços: O modelo demonstrou alta precisão e recall em ambos os conjuntos de dados. Para MAYV/CVB3, o recall foi de 0,9898 e a precisão de 0,9614; para VACV, o recall foi de 0,9920 e a precisão de 0,9841 (no limiar de IoU de 0,5). Os casos de falha limitaram-se principalmente a poços quase completamente transparentes com coloração mínima.
• Detecção de Placas:
  • Correlação: Fortes correlações lineares foram observadas entre contagens automatizadas e manuais. Para MAYV/CVB3, o coeficiente de correlação de Pearson foi 0,98 (N=180). Para VACV, foi 0,88 (N=126), com desempenho inferior atribuído a poços de alta densidade onde a sobreposição de placas é extensa.
  • Variabilidade Inter-especialista: Quando comparado a quatro especialistas independentes, o método automatizado mostrou alta concordância (Pearson r variando de 0,909 a 0,999). Em poços de baixa densidade, as discrepâncias foram frequentemente comparáveis à variabilidade observada entre especialistas humanos. Em poços de alta densidade, o modelo tendeu a subcontar devido à confluência, uma limitação compartilhada por anotadores humanos.
  • Análise de Erro: Erros relativos simétricos na contagem de placas foram geralmente baixos (< 0,2). A taxa de falsos positivos em poços vazios foi maior para MAYV/CVB3 (0,74) do que para VACV (0,50).
• Estimativa de UFP/mL: Para o conjunto de dados MAYV/CVB3, os valores automatizados de UFP/mL mostraram forte concordância com cálculos manuais (Pearson r = 0,975). A análise de Bland-Altman mostrou uma diferença média de 0,06 com limites de concordância de 95% variando de -0,31 a 0,44.
• Desempenho: Sem aceleração por GPU, a detecção de poços leva aproximadamente 4 segundos, e a segmentação de placas leva cerca de 4 segundos por poço.

Significado e Alegações
O artigo afirma que o sistema proposto fornece uma ferramenta prática, escalável e reproduzível para análise de ensaios de placas de laboratório. Ao aproveitar modelos fundamentais, o fluxo de trabalho alcança quantificação agnóstica ao vírus entre diferentes espécies virais (MAYV, CVB3, VACV) e formatos de placas, sem exigir hardware de imageamento especializado.

Os autores enfatizam que o sistema reduz substancialmente o esforço de anotação manual e a variabilidade entre operadores. Embora reconheçam limitações em poços de densidade extremamente alta (confluentes), o estudo demonstra que a abordagem automatizada produz resultados altamente concordantes com a contagem manual especializada e cálculos padrão de titulação. O lançamento da ferramenta de código aberto e do conjunto de dados curado visa permitir quantificação viral pronta para auditoria e reproduzível para a comunidade de pesquisa em geral.