fishROI: A specialized workflow for semi-automated muscle morphometry analysis in teleosts

Resumo Técnico: fishROI – Um Fluxo de Trabalho Especializado para Análise de Morfometria Muscular Semi-Automatizada em Teleósteos

Definição do Problema
A análise histológica quantitativa da morfometria do músculo esquelético é essencial para compreender a fisiologia, o crescimento e a regeneração muscular. No entanto, a quantificação manual tradicional é trabalhosa. Embora ferramentas baseadas em aprendizado de máquina tenham automatizado esse processo para modelos de mamíferos (ex: humanos, camundongos), elas falham quando aplicadas a teleósteos (peixes). As ferramentas existentes dependem fortemente de protocolos de coloração de matriz extracelular (MEC) ou membrana otimizados para mamíferos, o que frequentemente resulta em sinais fracos ou inconsistentes em tecidos de teleósteos, particularmente nos estágios larvais e juvenis. Além disso, os algoritmos padrão assumem fibras de tamanhos uniformes; essa suposição falha em teleósteos, que exibem "hiperplasia mosaica" — uma dinâmica de crescimento caracterizada pela adição contínua de fibras pequenas, recém-sintetizadas, de tamanhos variados. Consequentemente, as ferramentas existentes frequentemente classificam incorretamente essas fibras pequenas como artefatos de imagem, levando a uma segmentação imprecisa e à falta de uma visualização eficaz para a organização espacial e heterogeneidade morfométrica nos músculos de teleósteos.

Metodologia
Os autores conduziram um estudo de benchmarking abrangente e desenvolveram uma nova solução de software:

1. Benchmarking: Cinco fluxos de trabalho de morfometria muscular existentes (MuscleJ2, MyoVision, Myosoft, TRUEFAD e MacroIMRB) foram testados em seções de músculo de zebrafish juvenil coradas com WGA (MEC) e faloidina (citoplasma). O desempenho foi avaliado em relação a dados de verdade fundamental (ground truth) anotados manualmente.
2. Otimização da Coloração: O estudo comparou marcadores de MEC/membrana com coloração citoplasmática (faloidina), constatando que a faloidina fornece uma marcação consistente através dos estágios de desenvolvimento, incluindo fibras nascentes pequenas.
3. Avaliação de Algoritmos: Os autores testaram algoritmos de segmentação celular de propósito geral, especificamente a ferramenta de aprendizado raso Labkit e a ferramenta de aprendizado profundo Cellpose (usando o modelo pré-treinado cyto3). Eles também treinaram modelos customizados do Cellpose usando um conjunto de 54 imagens de confocal (19.840 ROIs curadas manualmente) abrangendo os estágios de larva inicial, larva tardia e juvenil precoce.
4. Desenvolvimento de Software: Um novo plugin para FIJI2 (ImageJ2) chamado fishROI foi desenvolvido em Jython. Ele integra uma Interface Gráfica do Usuário (GUI) modular para guiar o usuário através da segmentação, limpeza de ROI, quantificação e visualização.
   • Segmentação: Suporta tanto aprendizado raso (Labkit) quanto aprendizado profundo (Cellpose). Inclui ferramentas para converter ROIs do FIJI em formatos compatíveis com o treinamento do Cellpose.
   • Quantificação e Visualização: Inclui módulos para gerar mapas de calor morfométricos (área, circularidade, intensidade) e um método inovador para calcular o Coeficiente de Variação (CoV) das áreas das fibras dentro de janelas deslizantes para quantificar a hiperplasia mosaica.
   • Dependências Externas: O fluxo de trabalho utiliza um script Julia para mapas de calor de CoV e requer uma interface de linha de comando (CLI) para a execução do Cellpose, embora o fishROI facilite a transferência de dados e a geração de inputs.

Principais Resultados

• Ineficácia das Ferramentas Existentes: O benchmarking revelou que as ferramentas existentes, otimizadas para mamíferos, tiveram um desempenho insatisfatório em tecidos de teleósteos. O MuscleJ2 identificou <1% das fibras corretamente; o Myosoft falhou devido a erros de código; o TRUEFAD alcançou taxas de verdadeiros positivos de ~40%, mas gerou altos índices de falsos positivos; e o MacroIMRB identificou apenas ~10% das fibras. Todos falharam principalmente devido à dependência de coloração de MEC e às suposições de uniformidade das fibras.
• Superioridade da Coloração Citoplasmática + Aprendizado Profundo: A coloração por faloidina combinada com o modelo pré-treinado cy3 do Cellpose superou significativamente o Labkit e outros fluxos de trabalho. O Cellpose segmentou corretamente aproximadamente 80% das fibras em amostras de larva tardia e juvenil precoce, com uma taxa de falsos positivos abaixo de 20%, sem exigir retreinamento.
• Impacto do Treinamento Customizado: O treinamento de um modelo customizado "rerio" com dados específicos de zebrafish não aumentou significativamente a taxa de verdadeiros positivos em comparação ao modelo pré-treinado, mas reduziu significativamente a taxa de falsos positivos, melhorando a capacidade do algoritmo de rejeitar artefatos. Um único modelo universal mostrou-se suficiente para uma segmentação robusta através dos estágios de desenvolvimento.
• Quantificação da Hiperplasia Mosaica: O estudo demonstrou que o cálculo do Coeficiente de Variação (CoV) das áreas de seção transversal das fibras em regiões localizadas quantifica efetivamente a hiperplasia mosaica. Zebrafish juvenis (em hiperplasia ativa) mostraram valores de CoV significativamente elevados no miótomo profundo em comparação com larvas iniciais, validando a métrica como uma medida quantitativa de dinâmicas de crescimento.

Principais Contribuições
O artigo introduz o fishROI, um plugin modular de FIJI2 projetado especificamente para análise de músculo de teleósteos. Suas principais contribuições incluem:

• Fluxo de Trabalho Independente de Espécie: Um pipeline que não depende de protocolos de coloração restritos ou suposições morfológicas, acomodando a heterogeneidade das fibras musculares de teleósteos.
• Segmentação Integrada: Suporte contínuo tanto para segmentação de aprendizado raso quanto de aprendizado profundo, com ferramentas para facilitar o treinamento de modelos e conversão de ROI.
• Visualização Inovadora: Ferramentas para visualizar distribuições de tamanho de fibras e heterogeneidade espacial, permitindo especificamente a quantificação da hiperplasia mosaica via mapas de calor de CoV.
• Acessibilidade: Uma GUI intuitiva que simplifica todo o processo, desde a segmentação de imagem até a exportação de dados, mantendo-se flexível o suficiente para integrar outros métodos e fluxos de trabalho.

Significância
Os autores posicionam o fishROI como uma plataforma fundamental para a análise semi-automatizada de morfometria muscular em teleósteos. Ao abordar as limitações específicas das ferramentas focadas em mamíferos — nomeadamente sua dependência de coloração de MEC e suposições de uniformidade de fibras — o fluxo de trabalho permite uma análise confiável e de alto rendimento de zebrafish e outros modelos de teleósteos. A ferramenta facilita o estudo das dinâmicas de crescimento hiperplásico, uma característica crítica do desenvolvimento muscular de teleósteos que anteriormente era difícil de quantificar. Os autores afirmam que, embora validado em zebrafish, a estratégia de aprendizado de máquina subjacente e o design modular devem ser robustos para uma ampla gama de espécies de teleósteos e não-teleósteos, fornecendo uma base flexível para futuras adaptações na pesquisa muscular.