fishROI: A specialized workflow for semi-automated muscle morphometry analysis in teleosts

Resumen Técnico: fishROI – Un flujo de trabajo especializado para el análisis de la morfometría muscular semiautomatizada en teleósteos

Planteamiento del problema
El análisis histológico cuantitativo de la morfometría del músculo esquelético es esencial para comprender la fisiología, el crecimiento y la regeneración muscular. Sin embargo, la cuantificación manual tradicional requiere una gran inversión de tiempo y esfuerzo. Aunque existen herramientas basadas en aprendizaje automático que han automatizado este proceso para modelos de mamíferos (por ejemplo, humanos, ratones), estas fallan cuando se aplican a teleósteos (peces). Las herramientas existentes dependen en gran medida de protocolos de tinción de la matriz extracelular (MEC) o de la membrana optimizados para mamíferos, los cuales suelen producir señales débiles o inconsistentes en tejidos de teleósteos, particularmente en etapas larvarias y juveniles. Además, los algoritmos estándar asumen un tamaño de fibra uniforme; esta suposición falla en los teleósteos, que exhiben una "hiperplasia en mosaico": una dinámica de crecimiento caracterizada por la adición continua de fibras pequeñas de nuevo síntesis y tamaños variables. En consecuencia, las herramientas existentes frecuentemente clasifican erróneamente estas fibras pequeñas como artefactos de imagen, lo que deriva en una segmentación deficiente y una falta de visualización efectiva de la organización espacial y la heterogeneidad morfométrica en los músculos de los teleósteos.

Metodología
Los autores llevaron a cabo un estudio de benchmarking exhaustivo y desarrollaron una nueva solución de software:

1. Benchmarking: Se probaron cinco flujos de trabajo de morfometría muscular existentes (MuscleJ2, MyoVision, Myosoft, TRUEFAD y MacroIMRB) en secciones de músculo de zebrafish juvenil teñidas con WGA (MEC) y faloidina (citoplasma). El rendimiento se evaluó frente a datos de verdad de campo (ground truth) anotados manualmente.
2. Optimización de la tinción: El estudio comparó los marcadores de MEC/membrana frente a la tinción citoplasmática (faloidina), encontrando que la faloidina proporciona un etiquetado consistente a través de las etapas de desarrollo, incluyendo las fibras nacientes pequeñas.
3. Evaluación de algoritmos: Los autores probaron algoritmos de segmentación celular de propósito general, específicamente la herramienta de aprendizaje superficial Labkit y la herramienta de aprendizaje profundo Cellpose (utilizando el modelo preentrenado cyto3). Además, entrenaron modelos personalizados de Cellpose utilizando un conjunto de datos de 54 imágenes confocales (19,840 ROIs curados manualmente) que abarcan las etapas de larva temprana, larva tardía y juvenil temprano.
4. Desarrollo de software: Se desarrolló un nuevo plugin para FIJI2 (ImageJ2) llamado fishROI en Jython. Este integra una Interfaz Gráfica de Usuario (GUI) modular para guiar a los usuarios a través de la segmentación, la limpieza de ROIs, la cuantificación y la visualización.
   • Segmentación: Soporta tanto el aprendizaje superficial (Labkit) como el aprendizaje profundo (Cellpose). Incluye herramientas para convertir ROIs de FIJI a formatos compatibles con el entrenamiento de Cellpose.
   • Cuantificación y Visualización: Incluye módulos para generar mapas de calor morfométricos (área, circularidad, intensidad) y un método novedoso para calcular el Coeficiente de Variación (CoV) de las áreas de las fibras dentro de ventanas deslizantes para cuantificar la hiperplasia en mosaico.
   • Dependencias externas: El flujo de trabajo utiliza un script de Julia para los mapas de calor de CoV y requiere una interfaz de línea de comandos (CLI) para la ejecución de Cellpose, aunque fishROI facilita la transferencia de datos y la generación de entradas.

Resultados clave

• Ineficacia de las herramientas existentes: El benchmarking reveló que las herramientas optimizadas para mamíferos funcionaron deficientemente en tejidos de teleósteos. MuscleJ2 identificó <1% de las fibras correctamente; Myosoft falló debido a errores de código; TRUEFAD logró tasas de verdaderos positivos de aproximadamente el 40% pero generó altos niveles de falsos positivos; y MacroIMRB identificó solo un ~10% de las fibras. Todas fallaron principalmente debido a la dependencia de la tinción de la MEC y a las suposiciones de uniformidad de las fibras.
• Superioridad de la tinción citoplasmática + Aprendizaje Profundo: La tinción con faloidina combinada con el modelo preentrenado cy3 de Cellpose superó significativamente a Labkit y a otros flujos de trabajo. Cellpose segmentó correctamente aproximadamente el 80% de las fibras en muestras de larva tardía y juvenil temprano, con una tasa de falsos positivos inferior al 20%, sin requerir reentrenamiento.
• Impacto del entrenamiento personalizado: El entrenamiento de un modelo personalizado "rerio" con datos específicos de zebrafish no aumentó significativamente la tasa de verdaderos positivos en comparación con el modelo preentrenado, pero redujo significativamente la tasa de falsos positivos, mejorando la capacidad del algoritmo para rechazar artefactos. Se encontró que un único modelo universal es suficiente para una segmentación robusta a través de las etapas de desarrollo.
• Cuantificación de la hiperplasia en mosaico: El estudio demostró que el cálculo del Coeficiente de Variación (CoV) de las áreas de sección transversal de las fibras en regiones localizadas cuantifica eficazmente la hiperplasia en mosaico. Los zebrafish juveniles (en hiperplasia activa) mostraron valores de CoV significativamente elevados en el miotomo profundo en comparación con las larvas tempranas, validando la métrica como una medida cuantitativa de la dinámica de crecimiento.

Contribuciones clave
El artículo presenta fishROI, un plugin modular de FIJI2 diseñado específicamente para el análisis de músculo en teleósteos. Sus principales contribuciones incluyen:

• Flujo de trabajo independiente de la especie: Un pipeline que no depende de protocolos de tinción estrechos o suposiciones morfológicas, acomodando la heterogeneidad de las fibras musculares de los teleósteos.
• Segmentación integrada: Soporte fluido tanto para la segmentación por aprendizaje superficial como por aprendizaje profundo, con herramientas que facilitan el entrenamiento de modelos y la conversión de ROIs.
• Visualización novedosa: Herramientas para visualizar la distribución del tamaño de las fibras y la heterogeneidad espacial, permitiendo específicamente la cuantificación de la hiperplasia en mosaico mediante mapas de calor de CoV.
• Accesibilidad: Una GUI intuitiva que agiliza todo el proceso, desde la segmentación de imágenes hasta la exportación de datos, manteniendo la flexibilidad para integrarse con otras herramientas y flujos de trabajo.

Significancia
Los autores posicionan a fishROI como una plataforma fundacional para el análisis semiautomatizado de la morfometría muscular en teleósteos. Al abordar las limitaciones específicas de las herramientas actuales centradas en mamíferos —a saber, su dependencia de la tinción de la MEC y las suposiciones de uniformidad de las fibras—, el flujo de trabajo permite un análisis fiable y de alto rendimiento de los modelos de zebrafish y otros teleósteos. La herramienta facilita el estudio de las dinámicas de crecimiento hiperplásico, una característica crítica del desarrollo muscular de los teleósteos que anteriormente había sido difícil de cuantificar. Los autores sostienen que, aunque se validó en zebrafish, las estrategias de aprendizaje automático subyacentes y el diseño modular se espera que sean robustos en una amplia gama de especies de teleósteos y no teleósteos, proporcionando una base flexible para futuras adaptaciones en la investigación muscular.