Technical replicates and multiple sequencing approaches reveal weak and inconsistent microbiome signals in tumour and blood samples

Resumo Técnico: Réplicas Técnicas e Múltiplas Abordagens de Sequenciamento Revelam Sinais de Microbioma Fracos e Inconsistentes em Amostras de Tumor e Sangue

Definição do Problema
A literatura recente tem sugerido a existência de perfis microbianos únicos em tumores, sangue e outros locais corporais de baixa biomassa, potencialmente servindo como biomarcadores para o diagnóstico e tratamento do câncer. No entanto, existe uma controvérsia e inconsistência significativas em relação a essas descobertas. O principal desafio reside em distinguir sinais biológicos verdadeiros de artefatos técnicos em amostras com baixa biomassa microbiana, onde a proporção de DNA microbiano em relação ao DNA do hospedeiro é baixa. Essas amostras são altamente suscetíveis à contaminação por reagentes de laboratório, ferramentas de amostragem e ambientes de sequenciamento, levando a falsos positivos e dados não confiáveis. Enquanto amostras de alta biomassa (ex: fezes) produzem dados de microbioma robustos, a confiabilidade das metodologias atuais de sequenciamento de alto rendimento para amostras de baixa biomassa (tumor, tecido adjacente, sangue) permanece não comprovada e debatida.

Metodologia
Este estudo clínico prospectivo observacional analisou amostras de 70 pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) submetidos a ressecção curativa. O estudo empregou uma abordagem multifacetada para caracterizar os sinais microbianos em quatro tipos de amostras: tumor pulmonar, tecido pulmonar normal adjacente, sangue e saliva. Para testar rigorosamente a confiabilidade das metodologias atuais, os pesquisadores aplicaram quatro técnicas analíticas distintas às mesmas amostras biológicas, sempre que possível:

1. Sequenciamento do gene 16S rRNA de comprimento total: Utilizando plataformas PacBio Sequel II ou Vega com primers 27F/1492R para gerar leituras HiFi.
2. Sequenciamento de amplicon 16S aninhado de leitura curta: Uma abordagem de PCR em duas etapas visando as regiões V6-V8, sequenciada em Illumina MiSeq, projetada para superar o baixo aporte de DNA.
3. Sequenciamento Metagenômico (MGS): Sequenciamento shotgun em Illumina NextSeq2000, seguido de remoção rigorosa de leituras do hospedeiro (humano, PhiX, UniVec) e classificação taxonômica usando Kraken2 e Bracken, com verificação via GeCoCheck.
4. PCR Digital (dPCR): Utilizado para a quantificação absoluta de cópias do gene 16S rRNA para medir a biomassa bacteriana diretamente.

O desenho do estudo incluiu controles extensivos: controles negativos (swabs de instrumentos cirúrgicos), controles positivos (ZymoBIOMICS™ Microbial Community Standard e fezes humanas in-house) e réplicas técnicas (sequenciamento em duplicata do mesmo DNA extraído) para avaliar a reprodutibilidade. O processamento bioinformático seguiu pipelines padrão (QIIME2, DADA2, Deblur) com filtragem estrita para contaminantes e ASVs de baixa abundância.

Principais Resultados
O estudo gerou várias descobertas críticas em relação às limitações da detecção de microbioma atual em amostras de baixa biomassa:

• Falha do Sequenciamento de Comprimento Total: O sequenciamento 16S de comprimento total falhou em gerar dados utilizáveis para quase todas as amostras de tumor, tecido adjacente e sangue após a filtragem de qualidade. Em contraste, a saliva e os controles positivos retiveram altas contagens de leituras e perfis microbianos orais ou fecais típicos.
• Baixa Biomassa e Alta Variabilidade no Sequenciamento Aninhado: Embora o PCR aninhado tenha gerado dados de sequenciamento para amostras de baixa biomassa, essas amostras continham pouquíssimos taxa (mediana de 3–5 ASVs) e exibiram variabilidade substancial entre réplicas técnicas. A composição da comunidade em tumores, sangue e tecidos adjacentes foi indistinguível dos controles negativos.
• Falta de Reprodutibilidade: As réplicas técnicas de saliva e controles positivos agruparam-se de forma densa, demonstrando alta reprodutibilidade. Por outro lado, as réplicas de amostras de tumor, sangue e tecido adjacente foram altamente díspares, com distâncias UniFrac ponderadas indicando dissimilaridade significativa na composição da comunidade entre os duplicatas.
• Ausência de um Microbioma Central: Nenhum microbioma central consistente foi identificado em tumores, sangue ou tecidos adjacentes. Os gêneros mais abundantes nessas amostras (ex: Cutibacterium, Methylobacterium-Methylorubrum) também eram dominantes nos controles negativos, sugerindo que esses sinais provavelmente se originam de contaminação, e não de presença biológica.
• Discrepância entre 16S e Metagenômica: O sequenciamento metagenômico de amostras de baixa biomassa resultou em >99,8% das leituras classificadas como sequências humanas ou de vetores. Os poucos gêneros bacterianos detectados via MGS mostraram sobreposição mínima com os detectados via sequenciamento 16S aninhado. Em contrapartida, as amostras de saliva mostraram sobreposição significativa entre os dois métodos.
• Quantificação Absoluta Confirma Baixa Biomassa: O dPCR confirmou que a biomassa bacteriana em amostras de tumor, tecido adjacente e sangue era extremamente baixa (média de 6–39 cópias/µL), comparável aos controles negativos (7 cópias/µL), enquanto os controles de saliva e fezes mostraram biomassa ordens de magnitude superior (média de ~29.000 cópias/µL).

Significância e Alegações
O artigo conclui que as metodologias atuais de sequenciamento de alto rendimento lutam para detectar assinaturas microbianas em amostras de baixa biomassa que sejam distintas do ruído de fundo inerente aos ambientes de coleta e processamento. O estudo alega que a falta de precisão e reprodutibilidade nessas amostras torna difícil identificar biomarcadores microbianos robustos para o câncer usando protocolos padrão.

Os autores enfatizam que aparentes sinais microbianos em tecidos de baixa biomassa podem refletir artefatos técnicos em vez de fenômenos biológicos verdadeiros. Consequentemente, o estudo defende uma abordagem mais rigorosa para a pesquisa de microbioma de baixa biomassa, recomendando especificamente:

1. O uso de réplicas técnicas para avaliar a natureza estocástica do PCR e do sequenciamento em amostras de baixo DNA.
2. A aplicação de estratégias de sequenciamento alternativas (ex: comparar dados de amplicon vs. metagenômicos).
3. A inclusão de quantificação absoluta (dPCR) para sinalizar amostras com biomassa insuficiente antes do sequenciamento.
4. O uso estrito de controles negativos para distinguir sinais biológicos de contaminação.

Os autores afirmam modestamente que, embora seus achados desafiem a confiabilidade dos dados atuais de microbioma de tumor e sangue, eles fornecem insights essenciais sobre os desafios específicos de avaliar esses tipos de amostra e destacam a necessidade de múltiplos controles e métodos para validar qualquer potencial biomarcador de câncer.