Technical replicates and multiple sequencing approaches reveal weak and inconsistent microbiome signals in tumour and blood samples

Technische Samenvatting: Technische Replicaten en Meervoudige Sequencing-benaderingen Onthullen Zwakke en Inconsistente Microbioomsignalen in Tumoren en Bloedmonsters

Probleemstelling
Recente literatuur suggereert de aanwezigheid van unieke microbiële profielen binnen tumoren, bloed en andere locaties met een lage biomassa, die potentieel kunnen dienen als biomarkers voor de diagnose en behandeling van kanker. Er bestaat echter aanzienlijke controverse en inconsistentie met betrekking tot deze bevindingen. De primaire uitdaging ligt in het onderscheiden van echte biologische signalen van technische artefacten in monsters met een lage biomassa, waarbij de verhouding tussen microbiële en gastheer-DNA laag is. Deze monsters zijn zeer gevoelig voor contaminatie door laboratoriumreagentia, monsternemingsinstrumenten en sequencing-omgevingen, wat leidt tot fout-positieve resultaten en onbetrouwbare gegevens. Terwijl monsters met een hoge biomassa (bijv. ontlasting) robuuste microbioomgegevens opleveren, blijft de betrouwbaarheid van huidige high-throughput sequencing-methodologieën voor monsters met een lage biomassa (tumor, aangrenzend weefsel, bloed) onbewezen en onderwerp van debat.

Methodologie
Deze observationele prospectieve klinische studie analyseerde monsters van 70 patiënten met niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) die een curatieve resectie ondergingen. De studie maakte gebruik van een veelzijdige aanpak om microbiële signalen te karakteriseren over vier monstertypen: longtumor, aangrenzend normaal longweefsel, bloed en speeksel. Om de betrouwbaarheid van huidige methodologieën rigoureus te testen, pasten de onderzoekers vier verschillende analytische technieken toe op dezelfde biologische monsters waar mogelijk:

1. Full-length 16S rRNA-gen sequencing: Gebruikmakend van PacBio Sequel II of Vega-platforms met 27F/1492R primers om HiFi-reads te genereren.
2. Nested short-read 16S amplicon sequencing: Een twee-staps PCR-benadering gericht op de V6-V8 regio's, gesequenced op Illumina MiSeq, ontworpen om de beperkte DNA-input te overwinnen.
3. Metagenomische Sequencing (MGS): Shotgun sequencing op Illumina NextSeq2000, gevolgd door strikte verwijdering van gastheer-reads (mens, PhiX, UniVec) en taxonomische classificatie met behulp van Kraken2 en Bracken, met verificatie via GeCoCheck.
4. Digitale PCR (dPCR): Gebruikt voor de absolute kwantificering van 16S rRNA-genkopieën om bacteriële biomassa direct te meten.

Het studieontwerp bevatte uitgebreide controles: negatieve controles (swabs van chirurgische instrumenten), positieve controles (ZymoBIOMICS™ Microbial Community Standard en in-house menselijke ontlasting) en technische replicaten (dubbele sequencing van hetzelfde geëxtraheerde DNA) om de reproduceerbaarheid te beoordelen. De bioinformatische verwerking volgde standaard pipelines (QIIME2, DADA2, Deblur) met strikte filtering voor contaminanten en laag-abundante ASV's.

Belangrijkste Resultaten
De studie leverde verschillende cruciale bevindingen op met betrekking tot de beperkingen van de huidige microbiële detectie in monsters met een lage biomassa:

• Falen van Full-Length Sequencing: Full-length 16S-sequencing slaagde er niet in om bruikbare gegevens te genereren voor bijna alle tumor-, aangrenzend weefsel- en bloedmonsters na kwaliteitsfiltering. In tegen plaats behieldden speeksel en positieve controles hoge read-aantallen en typische orale of fecale microbiële profielen.
• Lage Biomassa en Hoge Variabiliteit in Nested Sequencing: Hoewel nested PCR succesvol sequentiegegevens genereerde voor monsters met een lage biomassa, bevatten deze monsters zeer weinig taxa (mediaan 3–5 ASV's) en vertoonden ze aanzienlijke variabiliteit tussen technische replicaten. De gemeenschapscompositie van tumor-, bloed- en aangrenzende weefsels was niet te onderscheiden van de negatieve controles.
• Gebrek aan Reproduceerbaarheid: Technische replicaten van speeksel en positieve controles clusterden nauw samen, wat een hoge reproduceerbaarheid aantoonde. Daarentegen waren de replicaten van tumor-, bloed- en aangrenzende weefsels sterk uiteenlopend, waarbij gewogen UniFrac-afstanden een significante dissimilariteit in gemeenschapscompositie tussen duplicaten aangaven.
• Afwezigheid van een Core Microbiome: Er werd geen consistent core microbiome geïdentificeerd in tumor-, bloed- of aangrenzende weefsels. De meest abundante genera in deze monsters (bijv. Cutibacterium, Methylobacterium-Methylorubrum) waren ook dominant in de negatieve controles, wat suggereert dat deze signalen waarschijnlijk afkomstig zijn van contaminatie in plaats van biologische aanwezigheid.
• Discrepantie tussen 16S en Metagenomics: Metagenomische sequencing van monsters met een lage biomassa resulteerde in >99,8% van de reads die geclassificeerd werden als menselijke of vector-sequenties. De enkele bacteriële genera die via MGS werden gedetecteerd, vertoonden minimale overlap met de genera die via nested 16S-sequencing werden gedetecteerd. In tegenstelling hiertoe vertoonden speekselmonsters een significante overlap tussen de twee methoden.
• Absolute Kwantificering Bevestigt Lage Biomassa: dPCR bevestigde dat de bacteriële biomassa in tumor-, aangrenzend weefsel- en bloedmonsters extreem laag was (gemiddeld 6–39 kopieën/µL), vergelijkbaar met negatieve controles (7 kopieën/µL), terwijl speeksel- en ontlastingscontroles orders van grootte hogere biomassa vertoonden (gemiddeld ~29.000 kopieën/µL).

Betekenis en Claims
Het artikel concludeert dat huidige high-throughput sequencing-methodologieën moeite hebben met het detecteren van microbiële signatures in monsters met een lage biomassa die verschillen van de achtergrondruis die inherent is aan de verzamelings- en verwerkingsomgevingen. De studie stelt dat het gebrek aan precisie en reproduceerbaarheid in deze monsters het moeilijk maakt om robuuste microbiële biomarkers voor kanker te identificeren met standaardprotocollen.

De auteurs benadrukken dat schijnbare microbiële signalen in weefsels met een lage biomassa een technisch artefact kunnen reflecteren in plaats van een echt biologisch fenomeen. Bijgevolg pleit de studie voor een meer rigoureuze aanpak van microbioomonderzoek met een lage biomassa, waarbij specifiek wordt aanbevolen:

1. Het gebruik van technische replicaten om de stochastische aard van PCR en sequencing in monsters met een lage DNA-concentratie te beoordelen.
2. De toepassing van alternatieve sequencingstrategieën (bijv. het vergelijken van amplicon- versus metagenomische data).
3. De inclusie van absolute kwantificering (dPCR) om monsters met onvoldoende biomassa te markeren voordat sequencing plaatsvindt.
4. Het strikt gebruik van negatieve controles om biologische signalen te onderscheiden van contaminatie.

De auteurs stellen bescheiden dat hoewel hun bevindingen de betrouwbaarheid van huidige tumor- en bloedmicrobioomdata uitdagen, ze essentiële inzichten bieden in de specifieke uitdagingen bij het beoordelen van deze monstertypes en de noodzaak van meerdere controles en methoden benadrukken om potentiële kankerbiomarkers te valideren.