Statistical tests for bivariate spatial association across multi-omics data with disjoint coordinates

技术摘要：针对具有不相交坐标的多组学数据的双变量空间关联统计检验

问题陈述

多模态空间组学的兴起使得在连续组织切片上测量多种高维数据类型（例如转录组学和代谢组学）或在同一切片上进行共检测成为可能。推断生物过程的一个主要目标是检测不同模态特征之间的统计关联。然而，目前的分析框架面临三个关键挑战：

1. 不相交的坐标集： 由于技术差异（例如 10x Genomics Visium 与 MALDI-MSI）导致的的空间分辨率和测量区域的不同，即使在图像对齐后，不同模态之间也不存在一一对应的映射关系。因此，标准的统计量（如联合分布和 Pearson 相关系数）是未定义的。
2. 当前实践中的信息丢失： 目前普遍采用的解决方案是将高分辨率的点（spots）聚合以匹配另一种模态的较低分辨率。这种“粒度化”过程丢弃了空间信息，并且未能充分利用数据的全分辨率。
3. 无效的零假设与假设： 许多现有的双变量关联检验（例如标准 Pearson 相关系数、朴素置换检验或某些版本的双变量 Moran's I）隐含地假设观测值是独立同分布（i.i.d.）或可交换的。由于空间自相关（SAC）的存在，这些假设在空间组学数据中是被违反的。因此，这些方法测试的是“随机化零假设”（任何变量中均不存在 SAC），而非“独立性零假设”（在给定 SAC 的情况下，变量之间不存在关联）。这会导致第一类错误率（Type I error rates）上升，并产生误导性的结论，即将单变量的空间模式误认为双变量的关联。

方法论

作者提出了一套可扩展的统计检验套件，旨在直接处理不相交的坐标集，同时显式地考虑两个变量中的 SAC。这些方法通过 R 语言包 sbivar 实现。

1. 基于独立性零假设的双变量 Moran's I

• 概念： 这是对双变量 Moran's I ($I_{xy} = x^T W y$) 的推广，应用于不相交坐标，其中权重矩阵 $W$ 的元素 $w_{ij}$ 随模态 X 的点 $i$ 与模态 Y 的点 $j$ 之间的距离而衰减。
• 方差估计： 与以往假设观测值是 i.i.d. 的方法不同，作者推导出了一个包含 SAC 的解析方差估计量。方差计算为 $\text{Var}(I_{xy}) = \text{tr}(W^T \hat{\Sigma}_x W \hat{\Sigma}_y)$，其中 $\hat{\Sigma}_x$ 和 $\hat{\Sigma}_y$ 是基于变差函数模型（例如 Matheron 估计量）推导出的自相关矩阵。
• 检验： 该检验统计量被假定为渐近标准正态分布。为了检测各种空间模式，测试了多个具有不同衰减参数的权重矩阵，并使用 Cauchy 组合检验（用于处理相关 p 值）对 p 值进行合并。

2. 双变量高斯过程 (GPs)

• 概念： 使用多元正态分布对来自两种模态的拼接观测向量 ($z$) 进行建模。协方差矩阵 $\Sigma$ 分解为：
  • 独立噪声。
  • 每个模态内的单变量 SAC ($\Sigma_{SAC}$)。
  • 代表感兴趣的关联的双变量空间协方差 ($\Sigma_{biv}$)。
• 检验： 使用得分检验（score test）来测试双变量关联的方差分量 ($\tau$) 为零的零假设。为了处理参数空间的边界问题，优选得分检验而非 Wald 或似然比检验。该方法测试正向和负向关联，并使用 Cauchy 组合检验在一定范围的长度尺度 ($l_{xy}$) 上合并 p 值。

3. 广义加性模型 (GAMs)

• 概念： 将每种模态的空间模式建模为空间的平滑函数，即二维薄板平滑样条（2D thin-plate smoothing splines, $s_x(c_i)$ 和 $s_y(e_j)$）。
• 处理不相交性： 拟合的样条曲面在数据凹包（concave hull）内均匀分布的公共网格上进行评估。计算这些评估曲面之间的协方差和相关性。
• 方差估计： 由于样条评估是相关的，标准的方差公式是无效的。作者使用 Delta 方法将样条系数的不确定性传播到相关性估计中，从而实现有效的 z 检验。
• 扩展： 该框架支持不同的结果分布（例如用于转录组学的负二项分布、用于代谢组学的 Gamma 分布），并可扩展为广义加性混合模型 (GAMMs)，以处理残余的 SAC。

4. 多图像分析

• 对于重复实验（多个组织切片），作者提出了一种务实的做法：分别为每个图像计算关联度量（例如 Moran's I 或样条相关性），然后将这些度量输入到考虑实验设计的线性模型中。这种方法量化了跨重复实验的变异性，而非单个图像内的变异性，从而自然地吸收了由 SAC 引起的变异。

核心贡献

• 理论进展： 本文重新定义了双变量空间关联的零假设，区分了“随机化零假设”（无 SAC）和“独立性零假设”（在给定 SAC 的情况下无关联）。它提供了针对不相交坐标集的双变量 Moran's I 和 GAM 的解析方差估计量。
• 方法论创新： 引入了三种可扩展的方法（双变量 Moran's I、双变量 GPs、GAMs），这些方法不需要点匹配或数据聚合，从而保留了空间分辨率。
• 软件实现： 开发了 sbivar R 包，为这些检验提供统一的接口，包括对单切片和多切片分析的支持。

结果

模拟研究：

• 第一类错误控制： 非参数和参数化模拟表明，许多现有方法（包括标准 Pearson 相关系数、双变量 Geary's C 和朴素置换检验）在存在单变量或双变量 SAC 时，都会出现第一类错误率上升的问题。相比之下，所提出的方法（基于独立性零假设的双变量 Moran's I、双变量 GPs 和 GAMs）能够成功控制第一类错误率。
• 功效 (Power)： 新方法通常在检测各种双变量模式（例如“条纹”、“区域”和高斯过程依赖）方面表现出良好的功效。虽然双变量 GPs 和 GAMs 计算量较大，但双变量 Moran's I 和 GAMs 在速度和功效之间提供了理想的平衡。
• 鲁棒性： 即使在存在对齐误差的情况下，这些方法仍能保持对第一类错误的控制，尽管随着畸变的增加，功效会有所下降。

真实数据应用：

• Godfrey 数据（人类肺部/乳腺癌）： 应用于共检测的转录组学和代谢组学。新方法识别出了被原始基于相关性的分析（使用了固定阈值）所遗漏的显著基因-代谢物对。值得注意的是，研究发现 Kallikrein 转录本（KLK10-13）与代谢物 PI 34:1 之间存在正向关联，将其与 PI3K/AKT 信号通路联系起来。
• Vicari 数据（小鼠大脑）： 应用于帕金森病模型。分析证实了一些先前的发现，但也揭示了新的关联，例如在纹状体中，CSRP1 转录本与棕榈酰基-L-肉碱之间存在正向联系，这与已知的星形胶质细胞-神经元脂质转移机制一致。

意义与主张

作者声称，他们的工作通过提供用于检测不相交坐标集双变量关联的有效统计工具，填补了空间多组学分析中的关键空白。他们认为，忽略 SAC 会导致虚假发现，而为了强制进行坐标匹配而进行的聚合会导致不必要的信息丢失。

本文适度地定位其贡献，将其视为对现有实践的必要修正：

• 它提供了首个在不相交坐标集上显式考虑 SAC 并测试独立性零假设的检验套件。
• 它提供了一个分析重复空间实验的实用框架，而无需进行极其复杂的单模型拟合。
• 它强调，有效的推断需要将单变量空间结构的估计与双变量关联的检验分离。

作者总结道，虽然没有哪种方法是完美的（例如，如果未对残余自相关进行建模，GAMs 可能会在处理短程 SAC 时遇到困难；或者 GPs 计算量巨大），但结合使用双变量 Moran's I 和 GAMs（并可能通过 GAMMs 进行确认），为发现具有生物学意义的空间共定位提供了一种稳健的策略。