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Escherichia coli–based Nanobody Production: High-Cell-Density Process Development and Benchmarking of Strain-Plasmid Combinations

本研究通过对诱导时机、温度及宿主菌株组合的优化，建立了一种稳健的大肠杆菌高细胞密度补料分批培养工艺，实现了功能性抗CD45纳米抗体超过2.5 g/L的产量，并证明了周质分泌在产量、热稳定性和折叠均匀性方面均优于胞质表达。

原作者： Jan-Angelus Meyer, Marie Beneke, Sadija Altmüller, Alexander Reeb, Jannis Künzl, Nathalie Opilo, Theo Weise, Christos Gouloudis, Rebekka Biedendieck, Rainer Krull

发布于 2026-07-08

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CC BY 4.0

原作者： Jan-Angelus Meyer, Marie Beneke, Sadija Altmüller, Alexander Reeb, Jannis Künzl, Nathalie Opilo, Theo Weise, Christos Gouloudis, Rebekka Biedendieck, Rainer Krull

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ⚕️ 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。阅读完整免责声明

大局观：在工厂里制造微型抗体机器人

想象一下，**纳米抗体（Nanobodies）**是微型且高度专业化的“机器人”，旨在抓取体内的特定目标（在本研究中，是一个被称为 CD45 的免疫细胞标记物）。这些机器人比全尺寸的抗体更小、更简单，因此更容易进行大规模生产。

这项研究中的科学家们想要建立一个高效的工厂，利用大肠杆菌（E. coli）来制造这些纳米抗体机器人。把细菌想象成“工人”，而工厂则是大型、受控的生物反应器（一个高科技的大型储罐）。

目标非常简单：尽可能多地、尽可能快地制造出高质量的机器人，且不损坏它们。

第一部分：调整工厂设置（工艺优化）

在制造机器人之前，团队必须先确定工厂的最佳设置。他们使用了一种称为“实验设计”（Doх）的方法，这就像厨师在烹饪的不同阶段品尝汤的味道，以找到盐分、热度和烹饪时间之间的完美平衡。

他们测试了机器上的三个主要“旋钮”：

何时启动组装线（诱导时机）： 是应该在细菌还年轻细小时就开始制造，还是等反应器里挤满了细菌后再开始？
- 发现： 他们发现，在细菌非常拥挤（高密度）时再开始生产效果最好。这就像是在施工队完全集结完毕并准备就绪之前，再发放蓝图。
保持工厂多热（温度）： 是应该高温快产，还是低温慢造？
- 发现： 较低的温度（约 21–22.5°C）效果最好。这就像烘焙一个精致的蛋糕；如果烤箱温度太高，蛋糕会烧焦或塌陷。较凉爽的环境有助于纳米抗体折叠成正确的形状，而不至于变得“杂乱无章”。
添加多少“启动剂”（诱导剂浓度）： 他们测试了添加不同量的化学触发剂（IPTG）。
- 发现： 令人惊讶的是，添加多少诱导剂其实并不太重要，只要足以启动过程即可。这可是个好消息，因为诱导剂很贵；通过使用较少的诱导剂，他们可以节省成本。

结果： 通过将工厂设置为“晚启动”（在罐子变满时）并“保持低温”，他们实现了巨大的产量：每升液体可产出超过 2.5 克纯净的纳米抗体。 那可是大量的微型机器人！

第二部分：选择合适的工人与蓝图（菌株与质粒基准测试）

接下来，团队提出了问题：“我们使用哪种细菌，以及我们如何向它们传递指令，这重要吗？”

他们测试了五种不同的细菌菌株（工人）与质粒（说明书）的组合。他们观察了两种主要的制造策略，即机器人在哪里构建：

策略 A：细胞内（胞质）。 机器人在细菌的主体内构建。
策略 B：细胞外（周质）。 机器人在细菌的“前厅”或外部空间构建并被推送到那里。

研究结果：

“最佳”工人： 一种名为 NEB Express® 的特定菌株，配合特定的说明书（使用名为 PelB 的信号肽），成为了冠军。它制造纳米抗体的速度最快。
“亚军”： 另一种名为 SHuffle® T7 Express 的菌株也表现出色，尤其是在细胞内构建机器人方面。
“失败者”： 一些常见的细菌菌株（如标准的 BL21）在处理这项特定工作时表现极差，几乎几乎没有任何产量。

核心教训： 这不仅仅关乎工人本身，更关乎工人与说明书之间的团队协作。优秀的工人配上错误的说明书会失败，优秀的说明书配上错误的工人也会失败。

第三 part：质量控制（机器人好用吗？）

如果制造出的机器人是损坏的或无法工作的，那么制造大量机器人也就毫无意义。团队必须检查其产品的质量。

1. “折叠”测试（热稳定性）：
想象纳米抗体是一件折纸作品。如果折叠正确，它就会很坚固；如果皱巴巴的，它在受热时就会轻易散架。

周质机器人（策略 B）： 这些就像折叠完美的折纸。在加热时，它们直到非常高的温度（约 73–74°C）仍能保持强韧、均匀。它们表现得非常一致且稳定。
胞质机器人（策略 A）： 这些则显得有些“凌乱”。它们显示出两个不同的熔点，这意味着部分群体折叠得很好，而另一部分则略显皱缩。它们在较低的温度（约 51–55°C）下就开始瓦解。
原因： “前厅”（周质）是这些特定机器人折叠的天然环境，而细胞内部是一个混乱、拥挤的地方，即使是那些专门设计的“超级菌株”也难以在此实现完美的折叠。

2. “抓取”测试（功能性）：
最后，他们测试了机器人是否真的能抓住目标。他们使用流式细胞仪（一种计数细胞的机器）来观察纳米抗体是否能粘附在 CD45 阳性的细胞上。

结果： 所有制造出来的机器人，无论是在细胞内还是细胞外构建的，都能完美工作。 它们都能紧紧抓住目标。

最终结论

论文得出结论，要在工厂环境下高效制造这些纳米抗体机器人，你需要：

等待直到细菌非常拥挤时再开始生产。
保持低温以确保它们折叠正确。
挑选正确的团队： NEB Express 细菌结合 PelB 说明书（在细胞外构建）是绝对的赢家，在速度和质量上都表现最优。

虽然在细胞内构建（使用 SHuffle 菌株）也表现良好并产生了功能性机器人，但在“前厅”（周质）构建所得到的产物更加统一、更强韧且更稳定。

简而言之： 科学家们建立了一条高速、高质量的纳米抗体生产线，证明了只要拥有正确的时机、温度和细菌团队，就可以大量生产功能性的医疗工具。

技术摘要：基于大肠杆菌（Escherichia coli）的纳米抗体生产：高细胞密度工艺开发与菌株-质粒组合基准测试

问题陈述
纳米抗体（NBs），即 VHH 单域抗体片段，因其紧凑的尺寸、稳定性和溶解度而具有显著的诊断和治疗潜力。虽然利用大肠杆菌进行微生物生产在规模化方面具有吸引力，但在受控的高细胞密度培养（HCDC）条件下，实现正确折叠且具有功能的纳米抗体的高产率仍缺乏充分的表征。关键挑战包括：形成分子内二硫键（这通常受到还原性细胞质的阻碍）、代谢负担以及工艺参数（诱导时机、温度）、宿主菌背景与亚细胞定位（细胞质 vs. 周质空间）之间复杂的相互作用。目前，将 HCDC 工艺优化与宿主菌株选择及产品质量（折叠均匀性和热稳定性）联系起来的数据集非常有限。

方法论
本研究采用系统性的两阶段方法，开发了一种用于生产抗人类 CD45 纳米抗体的稳健型大肠杆菌补料分批培养工艺：

通过实验设计（DoE）进行工艺优化：
- 平台： 在 2 L 搅拌罐生物反应器中以补料分批模式运行。
- 策略： 采用分数阶乘筛选设计，随后使用“洋葱型 D-最优设计（onion D-optimal design）”进行响应面法（RSM）。
- 变量： 诱导时的吸光度（OD $_{600nm}$ ）、诱导后温度以及 IPTG 浓度。
- 菌株： 初步筛选使用了含有细胞质表达构建体（pT7-Cyto）的 E. coli SHuffle T7 Express。
- 目标： 确定最大化纯化后纳米抗体浓度的最佳操作窗口。
菌株-质粒组合的基准测试：
- 选择： 基于初步的摇瓶筛选，选择了五种不同的宿主-质粒系统。这些系统包括细胞质生产（使用 E. coli SHuffle T7 Express 和 SHuffle Express）和周质分泌（使用带有 OmpA 或 PelB 信号肽的 E. coli NEB Express®）。E. coli BL21(DE3) 被用作对照参考。
- 条件： 所有培养均在源自 DoE 优化的严格标准化 HCDC 条件下进行（诱导 OD $_{600nm}$ $\approx$ 150，温度转移至 22.5 °C，20 小时生产期）。
- 指标： 体积生产率、生物量产量（Y $_{P/X}$ ）和底物产量（Y $_{P/S}$ ）。
产品质量表征：
- 纯化： 使用 Strep-tag 亲和层析。
- 鉴定与加工： 通过 SDS-PAGE 和印迹实验（Western blotting）评估分子量和 C 端完整性。
- 热稳定性： 使用纳米差示荧光扫描技术（nanoDSF）评估展开转变和折叠均匀性。
- 功能性： 通过对 CD45 阳性 Jurkat 细胞的流式细胞术，确认抗原结合活性。

关键结果

工艺优化： DoE 确定了诱导 OD $_{600nm}$ 和诱导后温度是产量的主要驱动因素，而 IPTG 浓度（在测试范围 80–650 µM 内）没有显著影响。
- 最佳窗口： 在 OD $_{600nm}$ 125–150 时进行后期诱导，并结合 21–22.5 °C 的生产温度，定义了一个稳健的操作窗口。
- 产量： 在这些条件下，纯化后的纳米抗体浓度超过 2.5 g L⁻¹。
菌株-质雷基准测试：
- 表现最优者： 带有 PelB 信号肽的 E. coli NEB Express®（周质空间）实现了最高的体积生产率（0.122 g L⁻¹ h⁻¹）和最终滴度（约 2.43 g L⁻¹）。E. coli SHuffle T7 Express（细胞质）紧随其后，产量约为 2.19 g L⁻¹。
- 宿主依赖性： 性能高度依赖于特定的宿主-构建体组合。例如，使用相同细胞质构建体的 E. coli BL21(DE3) 产量极低（<0.1 g L⁻¹），这凸显了相比于单纯的表达架构，宿主背景的重要性。
- 信号肽特异性： 在 NEB Express® 宿主内，PelB 信号肽在周质分泌方面的表现显著优于 OmpA。
产品质量与折叠：
- 热稳定性： nanoDSF 显示出生产路径之间的明显差异。周质制备品（NEB Express®）在高温下表现出单一且尖锐的展开转变（73.27–74.05 °C），表明其具有同质且热稳定的群体。相比之下，细胞质制备品（SHuffle 菌株）显示出双相展开曲线，具有较低的第一转变（51.62–55.31 °C）和第二转变（68.30–71.53 °C），表明其群体具有更高的异质性和变化的折叠状态。
- 功能性： 尽管热稳定性存在差异，流式细胞术证实所有测试的制备品（细胞质和周质）均保留了对 CD45 阳性 Jurkat 细胞的功能性结合。

意义与主张
作者声称，本研究建立了一个可控且可扩展的大肠杆菌纳米抗体生产平台，能够实现克/升级的滴度。该研究的主要贡献在于证明了高水平生产不仅是宿主菌株的功能，而是由诱导时机、温度、宿主背景和亚细胞定位的综合优化所决定的。

至关重要的是，本文指出产品质量取决于生产路径。虽然在工程化菌株（SHuffle）中的细胞质生产可以获得高滴度，但周质分泌（特别是使用 NEB Express® 配合 PelB）产生的纳米抗体具有更优越的热均匀性和稳定性，这可能是由于氧化环境促进了正确的二硫键形成。研究结论认为，对于需要高构象同质性的应用，周质分泌是更佳的选择；而如果能管理好折叠异质性，细胞质生产仍是可行的、高产的替代方案。这项工作为基于产量和产品质量指标选择生产策略提供了数据驱动的框架。

大局观：在工厂里制造微型抗体机器人

第一部分：调整工厂设置（工艺优化）

第二部分：选择合适的工人与蓝图（菌株与质粒基准测试）

第三 part：质量控制（机器人好用吗？）

最终结论

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