Escherichia coli–based Nanobody Production: High-Cell-Density Process Development and Benchmarking of Strain-Plasmid Combinations

技術要約：大腸菌を用いたナノボディ生産：高細胞密度プロセス開発および菌株・プラスミド組み合わせのベンチマーキング

問題提起
ナノボディ（NB）、またはVHH単一ドメイン抗体断片は、そのコンパクトなサイズ、安定性、および溶解性により、診断および治療において大きな潜在能力を有している。微生物によるEscherichia coli（大腸菌）での生産はスケーラビリティの観点から魅力的であるが、制御された高細胞密度培養（HCDC）条件下において、正しく折り畳まれた機能的なNBを高収量で得るための特性評価は依然として不十分である。主な課題には、分子内ジスルフィド結合の形成（多くの場合、還元的な細胞質によって阻害される）、発現に伴う代謝負荷、およびプロセスパラメータ（誘導タイミング、温度）、宿主菌株の背景、および細胞内局在（細胞質 vs ペリプラズム）の間の複雑な相互作用が含まれる。HCDCプロセス最適化と宿主菌株の選択、および製品の品質（折り畳みの均一性と熱安定性）を関連付ける既存のデータセットは限られている。

方法論
本研究では、抗ヒトCD45ナノボディの堅牢なフェドバッチプロセスを開発するために、体系的な二段階のアプローチを採用した：

1. 実験計画法（DoE）によるプロセス最適化：

   • プラットフォーム： フェドバッチモードで作動する2 L撹拌槽型バイオリアクター。
   • 戦略： 分割要因スクリーニング設計に続く、 「オニオンD-最適設計」を用いた応答曲面法（RSM）。
   • 変数： 誘導時の吸光度（OD$_{600nm}$）、誘導後の温度、およびIPTG濃度。
   • 菌株： 初期スクリーニングでは、細胞質発現コンストラクト（pT7-Cyto）を用いたE. coli SHuffle T7 Expressを使用した。
   • 目的： 精製後のナノボディ濃度を最大化するための最適な動作ウィンドウを特定すること。

2. 菌株・プラスミド組み合わせのベンチマーキング：

   • 選択： 事前の振盪フラスコスクリーニングに基づき、5つの異なる宿主–プラスミドシステムを選択した。これらには、細胞質生産（E. coli SHuffle T7 ExpressおよびSHuffle Expressを使用）とペリプラズム分泌（OmpAまたはPelBシグナルペプチドを用いたE. coli NEB Express®を使用）が含まれる。E. coli BL21(DE3)をリファレンスとして使用した。
   • 条件： すべての培養は、DoE最適化から得られた厳格に標準化されたHCDC条件下で行われた（誘導はOD$_{600nm}$ ~150、温度シフトは22.5 °C、生産フェーズは20時間）。
   • 指標： 体積生産性、バイオマスに対する収率（Y$_{P/X}$）、および基質に対する収率（Y$_{P/S}$）。

3. 製品品質の特性評価：

   • 精製： Strep-tagアフィニティークロマトグラフィー。
   • 同定およびプロセシング： SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを用いて、分子量およびC末端の完全性を評価した。
   • 熱安定性： ナノ微分走査蛍光法（nanoDSF）を用いて、アンフォールディング転移および折り畳みの均一性を評価した。
   • 機能性： CD45陽性Jurkat細胞を用いたフローサイトメトリーにより、抗原結合能を確認した。

主な結果

• プロセス最適化： DoEにより、誘導OD$_{600nm}$と誘導後温度が収量の主要な駆動力であることが特定された一方、IPTG濃度（テストされた80–650 µMの範囲内）は有意な影響を及ぼさなかった。

  • 最適ウィンドウ： OD$_{600nm}$ 125–150での遅延誘導と、21–22.5 °Cの生産温度の組み合わせが、堅牢な動作ウィンドウを定義した。
  • 収量： これらの条件下で、精製されたナノボディ濃度は2.5 g L⁻¹を超えた。

• 菌株・プラスミドのベンチマーキング：

  • トップパフォーマー： PelBシグナルペプチドを用いたE. coli NEB Express®（ペリプラズム）が、最も高い体積生産性（0.122 g L⁻¹ h⁻¹）と最終的なタイター（2.43 g L⁻¹）を達成した。E. coli SHuffle T7 Express（細胞質）が、2.19 g L⁻¹で僅差で続いた。
  • 宿主依存性： パフォーマンスは、特定の宿主–コンストラクトの組み合わせに強く依存していた。例えば、同じ細胞質コンストラクトを用いたE. coli BL21(DE3)は、極めて微量（<0.1 g L⁻¹）しか産生せず、発現アーキテクチャ単独よりも宿主の背景が重要であることを浮き彫りにした。
  • シグナルペプチドの特異性： NEB Express®宿主内では、ペリプラズム分泌においてPelBシグナルペプチドがOmpAを大幅に上回った。

• 製品品質と折り畳み：

  • 熱安定性： nanoDSFは、生産経路による明確な違いを明らかにした。ペリプラズム調製物（NEB Express®）は、高温域（73.27–74.05 °C）で単一かつ鋭いアンフォールディング転移を示し、均質で熱的に安定した集団であることを示した。対照的に、細胞質調製物（SHuffle株）は、より低い第1転移（51.62–55.31 °C）と第2転移（68.30–71.53 °C）を伴う二相性のアンフォールディングプロファイルを示し、異なる折り畳み状態を持つ不均質な集団であることを示唆した。
  • 機能性： 熱安定性の違いにもかかわらず、フローサイトメトリーにより、すべてのテストされた調製物（細胞質およびペリプラズム）がCD45陽性Jurkat細胞に対する機能的な結合能を保持していることが確認された。

意義および主張
著者らは、本研究が、グラム単位のタイターを達成する大腸菌を用いたナノボディ生産の制御可能でスケーラブルなプラットフォームを確立したと主張している。本研究の主要な貢献は、高レベルの生産が単に宿主菌株の関数ではなく、誘導タイミング、温度、宿主背景、および細胞内局在の統合的な最適化によって支配されることを実証した点にある。

決定的なことに、本論文は、製品の品質が経路に依存することを論じている。エンジニアリングされた株（SHuffle）を用いた細胞質生産は高いタイターを実現できるが、ペリプラズム分泌（特にNEB Express®とPelBの使用）は、正しいジスルフィド結合の形成を促進する酸化的な環境により、より優れた熱的均一性と安定性を持つナノボディを生成する。本研究は、高いコンフォメーションの均一性を必要とする用途にはペリプラズム分泌が好ましい経路であり、一方で細胞質生産は、折り畳みの不均一性が管理されている場合には、依然として高収量の代替案となり得ると結論付けている。本研究は、収量と製品品質の両方の指標に基づいて生産戦略を選択するための、データ駆動型のフレームワークを提供するものである。