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Escherichia coli–based Nanobody Production: High-Cell-Density Process Development and Benchmarking of Strain-Plasmid Combinations

본 연구는 유도 시기, 온도 및 숙주 균주 조합의 최적화를 통해 기능성 anti-CD45 나노바디를 2.5 g/L 이상의 수율로 달성하는 강력한 고세포밀도 유가식 배양 공정을 대장균(E. coli)에서 확립하였으며, 이 과정에서 periplasmic 분비가 세포질 생산에 비해 수율, 열 안정성 및 접힘 균일도 측면에서 우수함을 입증하였다.

원저자: Jan-Angelus Meyer, Marie Beneke, Sadija Altmüller, Alexander Reeb, Jannis Künzl, Nathalie Opilo, Theo Weise, Christos Gouloudis, Rebekka Biedendieck, Rainer Krull

게시일 2026-07-08

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CC BY 4.0

원저자: Jan-Angelus Meyer, Marie Beneke, Sadija Altmüller, Alexander Reeb, Jannis Künzl, Nathalie Opilo, Theo Weise, Christos Gouloudis, Rebekka Biedendieck, Rainer Krull

원본 논문은 CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 라이선스로 제공됩니다. ⚕️ 이것은 동료 심사를 거치지 않은 프리프린트의 AI 생성 설명입니다. 의학적 조언이 아닙니다. 이 내용을 바탕으로 건강 관련 결정을 내리지 마세요. 전체 면책 조항 읽기

큰 그림: 공장에서 아주 작은 항체 로봇 만들기

**나노바디(Nanobodies)**를 특정 표적(이 경우에는 면역 세포에서 발견되는 CD45라는 마커)을 붙잡도록 설계된 작고 매우 특화된 "로봇"이라고 상상해 보세요. 이 로봇들은 일반적인 항체보다 훨씬 작고 단순해서 대량 생산하기가 더 쉽습니다.

이 연구의 과학자들은 이 나노바디 로봇을 만들기 위해 E. coli(대장균)를 사용하는 매우 효율적인 공장을 구축하고자 했습니다. 박테리아를 '일꾼'으로, 공장을 '대형 고성능 바이오리액터(거대한 첨단 탱크)'라고 생각하면 됩니다.

목표는 간단했습니다. 최대한 많은 양의 고품질 로봇을, 최대한 빠르게, 망가뜨리지 않고 만드는 것이었습니다.

파트 1: 공장 설정 조절하기 (공정 최적화)

로봇을 만들기 전에, 팀은 공장의 완벽한 설정을 찾아야 했습니다. 그들은 "실험 계획법(Design of Experiments, DoE)"이라는 방법을 사용했는데, 이는 마치 요리사가 소금, 열기, 조리 시간의 완벽한 균형을 찾기 위해 여러 단계에 걸쳐 국물 맛을 보는 것과 같습니다.

그들은 기계의 세 가지 주요 "조절 노브(knob)"를 테스트했습니다:

조립 라인을 시작할 시점 (유도 타이밍): 박테리아가 어리고 작을 때 로봇 제작을 시작해야 할까요, 아니면 탱크에 박테리아가 가득 찼을 때 시작해야 할까요?
- 발견: 그들은 로봇 제작을 시작하기 전에 탱크가 매우 북적거릴 때(높은 박테리아 밀도)까지 기다리는 것이 가장 좋다는 것을 발견했습니다. 이는 마치 건설 현장에 설계도를 전달하기 전에 모든 건설 인력이 완전히 모일 때까지 기다리는 것과 같습니다.
공장의 온도 (온도): 뜨겁고 빠르게 유지해야 할까요, 아니면 시원하고 신중하게 유지해야 할까요?
- 발견: 낮은 온도(약 21–22.5°C)가 가장 효과적이었습니다. 섬세한 케이크를 굽는 것과 같다고 생각하세요. 오븐이 너무 뜨거우면 케이크가 타거나 주저앉을 수 있습니다. 시원한 환경은 나노바디가 "엉키지" 않고 올바른 모양으로 접히는 데 도움을 주었습니다.
"스타터"를 얼마나 넣을 것인가 (유도제 농도): 그들은 화학적 트리거(IPTX)를 서로 다른 양으로 추가하며 테스트했습니다.
- 발견: 놀랍게도, 프로세스를 시작할 수 있을 만큼만 충분하다면 트리거를 얼마나 많이 넣는지는 크게 중요하지 않았습니다. 이는 매우 좋은 소식입니다. 트리거는 비싸기 때문에, 적은 양을 사용하여 비용을 절감할 수 있기 때문입니다.

결과: 공장 설정을 (박테리아가 가득 찼을 때) 늦게 시작하고 시원하게 유지함으로써, 그들은 엄청난 산출량을 달성했습니다: 액체 1리터당 2.5그램 이상의 순수 나노바디! 정말 많은 수의 작은 로봇들입니다!

파트 2: 적절한 일꾼과 설계도 선택하기 (균주 및 플라스미드 벤치마킹)

다음으로, 팀은 다음과 같은 질문을 던졌습니다: "어떤 박테리아를 사용하는지, 그리고 어떻게 지침을 전달하는지가 중요할까?"

그들은 다섯 가지 다른 박테리아 균주(일꾼)와 플라스미드(설명서)의 조합을 테스트했습니다. 또한 로봇이 어디에서 만들어져야 하는지에 대한 두 가지 주요 전략을 살펴보았습니다:

전략 A: 세포 내부 (Cytoplasmic). 로봇이 박테리아의 본체 내부에서 만들어집니다.
전략 B: 세포 외부 (Periplasmic). 로봇이 만들어진 후 박테리아의 "현관" 또는 외부 방으로 밀려 나갑니다.

연구 결과:

"최고의" 일꾼: **NEB Express®**라고 불리는 특정 균주와 특정 설명서(PelB라고 불리는 신호 펩타이드를 사용함)의 조합이 챔피언이었습니다. 이 조합이 시간당 가장 많은 나노바디를 생산했습니다.
"준우승": SHuffle® T7 Express라는 또 다른 균주도 특히 세포 내부에서 로봇을 만드는 데 있어 매우 뛰어난 성능을 보였습니다.
"낙제점": 일부 흔한 박테리아 균주(표준 BL21 같은)는 이 특정 작업에 형편없었으며, 거의 아무것도 생산하지 못했습니다.

핵심 교훈: 중요한 것은 단순히 일꾼뿐만이 아닙니다. 바로 일꾼과 설명서 사이의 팀워크입니다. 훌륭한 일꾼이라도 잘못된 설명서를 가지고 있으면 실패하고, 훌륭한 설명서라도 잘못된 일꾼과 함께라면 실패합니다.

파트 3: 품질 관리 (로봇이 좋은 상태인가?)

로봇을 많이 만드는 것도 중요하지만, 만약 로봇이 고장 났거나 작동하지 않는다면 무용지물입니다. 팀은 제품의 품질을 확인해야 했습니다.

1. "접힘" 테스트 (열 안정성):
나노바디를 종이접기 작품이라고 상상해 보세요. 제대로 접혔다면 튼튼할 것입니다. 하지만 구겨졌다면 열을 가했을 때 쉽게 부서질 것입니다.

세포 외부 로봇 (전략 B): 이들은 완벽하게 접힌 종이접기와 같았습니다. 열을 가해도 매우 높은 온도(약 73–74°C)까지 강하고 균일하게 유지되었습니다. 이들은 일관성이 있고 안정적이었습니다.
세로 내부 로봇 (전략 A): 이들은 다소 "지저도"했습니다. 두 개의 서로 다른 녹는점을 보였는데, 이는 일부 개체군은 잘 접혀 있는 반면, 다른 개체들은 약간 구겨져 있음을 의미합니다. 이들은 더 낮은 온도(약 51–55°C)에서 분해되기 시작했습니다.
이유는? "현관"(periplasm)은 이러한 특정 로봇들이 접히기에 적합한 자연스러운 환경인 반면, 세포 내부는 훨씬 더 혼란스럽고 붐비는 장소여서 접힘을 더 어렵게 만들기 때문입니다.

2. "움켜쥐기" 테스트 (기능성):
마지막으로, 그들은 로봇이 실제로 표적을 잡을 수 있는지 테스트했습니다. 그들은 유세포 분석기(세포를 세는 기계)를 사용하여 나노바디가 CD45 양성 세포에 달라붙는지 확인했습니다.

결과: 내부에서 만들어졌든 외부에서 만들어졌든 관계없이, 만들어진 모든 로бо트가 완벽하게 작동했습니다. 그들은 모두 표적을 단단하게 붙잡았습니다.

최종 결론

이 논문은 공장 환경에서 이러한 나노봇 로봇을 효율적으로 만들기 위해서는 다음이 필요하다고 결론짓습니다:

생산량을 시작하기 전까지 박테리아가 매우 북적거릴 때까지 기다릴 것.
올바르게 접히도록 시원하게 유지할 것.
올바른 팀을 선택할 것: NEB Express 박테리아와 PelB 설명서의 조합(세포 외부에서 제작)이 속도와 품질 면에서 압도적인 승자였습니다.

세포 내부에서 만드는 것(SHuffle 균주 사용)도 잘 작동하며 기능적인 로봇을 생산했지만, "현관"(periplasm)에서 만드는 것이 더 균일하고, 더 강하며, 더 안정적인 제품을 만들어냈습니다.

요약하자면: 과학자들은 나노바디를 위한 고속, 고품질 생산 라인을 구축했으며, 적절한 타이밍, 온도, 그리고 박테리아 팀이 있다면 기능적인 의료 도구를 대량으로 생산할 수 있음을 증명했습니다.

기술 요약: Escherichia coli 기반 나노바디 생산: 고세포 밀도 공정 개발 및 균주-플라스미드 조합의 벤치마킹

문제 정의
나노바디(NB) 또는 VHH 단일 도메인 항체 파편은 그의 콤팩트한 크기, 안정성 및 용해도로 인해 상당한 진단 및 치료적 잠재력을 보유하고 있다. 미생물을 이용한 생산은 확장성 측면에서 매력적이지만, 제어된 고세포 밀도 배양(HCDC) 조건 하에서 올바르게 접힌(folded) 기능적 나노바디를 높은 수율로 얻는 것은 여전히 충분히 규명되지 않았다. 주요 과제로는 (종종 환원적인 세포질에 의해 저해되는) 분자 내 이황화 결합 형성, 발현에 따른 대사 부담, 그리고 공정 파라미터(유도 시점, 온도), 숙주 균주 배경, 그리고 세포 내 위치 타겟팅(세포질 대 주변세포질) 사이의 복잡한 상호작용이 있다. HCDC 공정 최적화와 숙주-균주 선택 및 제품 품질(접힘 균일성 및 열 안정성)을 연결하는 기존 데이터셋은 제한적이다.

방법론
본 연구는 anti-human CD45 나노바디를 위한 견고한 유가식 배양(fed-batch) 공정을 개발하기 위해 체계적인 2단계 접근 방식을 채택하였다:

실험 계획법(DoE)을 통한 공정 최적화:
- 플랫폼: 2 L 교반 탱크 생물 반응기를 유가식 모드로 운용.
- 전략: 분획 요인 선별 설계(fractional factorial screening design) 후 "Onion D-optimal design"을 사용한 반응 표면 분석법(RSM) 적용.
- 변수: 유도 시점의 광학 밀도( $OD_{600nm}$ ), 유도 후 온도, IPTG 농도.
- 균주: 초기 선별에는 세포질 발현 컨스트럭트(pT7-Cyto)를 가진 E. coli SHuffle T7 Express를 사용하였다.
- 목표: 정제 후 나노바디 농도를 극대화하는 최적의 운용 범위를 식별.
균주-플라스미드 조합의 벤치마킹:
- 선택: 예비 흔들림 플라스크(shake-flask) 선별을 바탕으로 5가지의 서로 다른 숙주-플라스미드 시스템을 선정하였다. 여기에는 세포질 생산(SHuffle T7 Express 및 SHuffle Express 사용)과 주변세포질 분비(OmpA 또는 PelB 신호 서열을 사용하는 NEB Express® 사용)가 포함되었다. E. coli BL21(DE3)는 대조군 역할을 하였다.
- 조건: 모든 배양은 (DoE 최적화로부터 도출된) 엄격하게 표준화된 HCDC 조건(OD $_{600nm}$ ~150에서 유도, 22.5 °C로 온도 변화, 20시간 생산 단계) 하에서 수행되었다.
- 지표: 체적 생산성, 생물량 대비 수율( $Y_{P/X}$ ), 기질 대비 수율( $Y_{P/S}$ ).
제품 품질 특성 분석:
- 정제: Strep-tag 친화성 크로마토그래피.
- 동질성 및 가공: 분자량 및 C-말단 무결성을 평가하기 위한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅.
- 열 안정성: 펼침 전이(unfolding transitions)와 접힘 균일성을 평가하기 위한 나노 미분 스캐닝 형광법(nanoDSF).
- 기능성: CD45 양성 Jurkat 세포를 이용한 유세포 분석을 통해 항원 결합 활성 확인.

주요 결과

공정 최적화: DoE 결과, 유도 $OD_{600nm}$ 와 유도 후 온도가 수율의 주요 동인인 것으로 확인되었으며, IPTG 농도(테스트된 범위인 80–650 µM 내에서)는 유의미한 영향을 미치지 않았다.
- 최적 범위: $OD_{600nm}$ 125–150에서의 후기 유도와 21–22.5 °C의 생산 온도가 결합되어 견고한 운용 범위를 정의하였다.
- 수율: 이러한 조건 하에서 정제된 나노바디 농도는 2.5 g L⁻¹를 초과하였다.
균주-플라스미드 벤치마킹:
- 최우수 성과군: PelB 신호 서열을 가진 E. coli NEB Express®(주변세포질)가 가장 높은 체적 생산성(0.122 g L⁻¹ h⁻¹)과 최종 역가(titer) 약 2.43 g L⁻¹를 달성하였다. E. coli SHuffle T7 Express(세포질)가 약 2.19 g L⁻¹로 그 뒤를 바짝 쫓았다.
- 숙주 의존성: 성능은 특정 숙주-컨스트럭트 조합에 크게 의존하였다. 예를 들어, 동일한 세포질 컨스트럭트를 사용했음에도 E. coli BL21(DE3)는 무시할 만한 양(<0.1 g L⁻¹)만을 생성하였는데, 이는 발현 구조 자체보다 숙주 배경의 중요성을 강조한다.
- 신호 서열 특이성: NEB Express® 숙주 내에서 PelB 신호 서열이 주변세포질 분비를 위해 OmpA보다 성능이 현저히 우수하였다.
제품 품질 및 접힘(Folding):
- 열 안정성: NanoDSF는 생산 경로 간의 뚜렷한 차이를 보여주었다. 주변세포질 제조물(NEB Express®)은 고온(73.27–74.05 °C)에서 단일하고 날카로운 펼침 전이를 나타내어, 균일하고 열적으로 안정적인 집단을 시사하였다. 반면, 세포질 제조물(SHuffle 균주)은 낮은 첫 번째 전이(51.62–55.31 °C)와 두 번째 전이(68.30–71.53 °C)를 보이는 이상성(biphasic) 펼침 프로파일을 보여, 다양한 접힘 상태를 가진 더 불균일한 집단을 시사하였다.
- 기능성: 열 안정성의 차이에도 불구하고, 유세포 분석을 통해 모든 테스트된 제조물(세포질 및 주변세포질)이 CD45 양성 Jurkat 세포에 대한 기능적 결합력을 유지함을 확인하였다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 g/L 단위의 역가를 달하는 E. coli 기반의 제어 가능한 나노바디 생산 플랫폼을 확립한다고 주장한다. 본 연구의 주요 기여는 고수율 생산이 단순히 숙주 균주만의 기능이 아니라, 유도 시점, 온도, 숙주 배경 및 세포 내 위치 타겟팅의 통합적인 최적화에 의해 결정된다는 것을 입증한 데 있다.

결정적으로, 논문은 제품 품질이 경로 의존적이라고 주장한다. 엔지니어링된 균주(SHuffle)를 이용한 세포질 생산은 높은 역가를 얻을 수 있지만, 주변세포질 분비(특히 PelB를 사용하는 NEB Express®)는 올바른 이황화 결합 형성을 촉진하는 산화적 환경 덕분에 더 우수한 열적 균일성과 안정성을 가진 나노바디를 생성한다. 본 연구는 높은 형태적 균일성이 요구되는 응용 분야에는 주변세포질 분비가 더 바람직한 경로인 반면, 세포질 생산은 접힘의 불균일성이 관리될 수 있다면 여전히 실행 가능한 고수율 대안이 될 수 있다고 결론짓는다. 이 작업은 수율과 제품 품질 지표 모두를 기반으로 생산 전략을 선택하기 위한 데이터 기반 프레임워크를 제공한다.

큰 그림: 공장에서 아주 작은 항체 로봇 만들기

파트 1: 공장 설정 조절하기 (공정 최적화)

파트 2: 적절한 일꾼과 설계도 선택하기 (균주 및 플라스미드 벤치마킹)

파트 3: 품질 관리 (로봇이 좋은 상태인가?)

최종 결론

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