Combination of the extract from Phellinus linteus with Smilax spp. attenuates colorectal and prostate cancers

技术摘要：结合云芝（Phellinus linteus）与千层藤属（Smilax spp.）可减轻结直肠癌与前列腺癌

问题陈述
尽管目前已有常规癌症治疗手段（手术、化疗、激素疗法），但死亡率和治疗副作用仍然很高。人们对利用天然化合物作为辅助疗法以提高生存率并降低毒性的兴趣日益浓厚。虽然传统的泰国草药疗法，特别是云芝（PL，一种药用真菌）和千层藤属（Smilax spp.，特指千层藤 Smilax corbularia 与 葛藤 Smilax glabra，结合 PL 后统称为 PSS）在历史上曾被用于癌症治疗，但其具体的机制以及针对结直肠癌和前列腺癌的功效仍需严谨的科学验证。以往关于这些草药的研究局限于乳腺癌，或过度依赖于不完全探索免疫调节或体内转化潜力的体外共培养研究。

研究方法
本研究采用了一种多维度的研究方法，结合了体外细胞培养、分子分析、免疫细胞调节实验以及体内异种移植模型。

• 细胞系： 研究使用了三种结直肠癌细胞系（HCT116、SW620、HT-29）、一种前列腺癌细胞系（PC3），以及一种非癌性肾细胞系（HEK 293）用于毒性和机制研究。巨噬细胞由 THP-1 单核细胞衍生而来。
• 提取物制备： 通过使用蒸馏水按 3:1:1 的比例提取 PL 子实体和千层藤属根茎，制备出混合物（PSS）。同时制备了纯 PL 提取物。
• 细胞毒性与细胞周期： 通过 MTT 检测评估细胞毒性以确定 IC50 值。使用碘化丙啶（PI）染色通过流式细胞术分析细胞周期分布。使用 Annexin V/PI 染色评估细胞凋亡。
• 基因表达： 进行 RT-qPCR 以分析增殖相关基因（MDM2、KRAS 和 MKI67）的表达情况。
• 免疫调节（TAMs）： 使用 HCT116 条件培养基诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。评估了提取物对 TAM 极化（M1 型 vs. M2 型）、细胞因子分泌（TNF-α、IL-6、IL-10）以及杀伤肿瘤活性（通过与 CFSE 标记的癌细胞共培养测量）的影响。
• 体内模型： 在雄性裸鼠 BALB/c 中建立 HCT116 细胞皮下异种移植模型。小鼠在接种肿瘤两周后，接受 PL、PSS 或生理盐水的局部注射。在 30 天内监测肿瘤体积和体重。

关键结果

• 细胞毒性： PL 和 PSS 对结直肠癌和前列腺癌细胞系均表现出剂量依赖性的细胞毒性。PSS 比单独使用 PL 具有更强的抗癌作用（较低的 IC50 值）。PSS 对 SW620 细胞的毒性最强，对 HEK 293 细胞的毒性最小。顺铂仍是整体效力最强的药物。
• 细胞周期与凋亡： PSS 有效诱导了所有结直肠细胞系的 G2 期细胞周期阻滞，但未阻滞 PC3 细胞。PL 仅在 HT-29 和 SW620 中诱导了 G2 期阻滞。与顺铂相比，两种提取物诱导的凋亡率均较低（<5%）。
• 基因表达： 两种提取物均降低了所有癌细胞类型的 MDM2 表达。两种提取物均降低了 HCT116、HT-29 和 PC3 中的 MKI67 表达。KRAS 表达呈现出不同的反应：在 HT-29 和 PC3 中下调，在 HCT116 中上调，在 SW620 中保持不变。
• 免疫调节： 癌症条件培养基诱导了巨噬细胞向 M2 型极化（Fizz-1、TGF-β、Arg-1、IL-6、IL-10 上调；IL-1β、iNOS、TNF-α 下调）。PL 和 PSS 均逆转了这一趋势，通过上调 M1 标志物（IL-1β、iNOS）并下调 M2 标志物来实现。然而，只有 PSS 显著降低了 Arg-1 的表达，并在与 CFSE 染色的癌细胞共培养实验中展示了杀伤肿瘤的作用。
• 体内功效： 在小鼠异种移植模型中，给予 PSS 显著减轻了 HCT116 注射小鼠的肿瘤体积。由于溶解度限制导致无法在体内使用有效浓度，PL 的给药并未显示出显著的肿瘤体积减少。

主要贡献

1. 比较效力： 本研究证实，将云芝与千层藤属结合（PSS）在体外减轻结直肠癌和前列腺癌细胞增殖以及体内减轻肿瘤生长方面，比单独使用云芝更有效。
2. 机制见解： 研究确定了 PSS 的抗癌机制涉及直接细胞毒性（G2 期阻滞）和调节肿瘤微环境，特别是通过将巨噬细胞极化从促肿瘤的 M2 表型转向抗肿瘤的 M1 表型。
3. 基因-表型相关性： 研究强调，PSS 的细胞毒性并不严格取决于特定基因（如 MDM2 或 KRAS）在所有细胞系中的下调，这表明其具有可能独立于特定 p53 或 KRAS 突变状态的多靶点机制。
4. 转化概念验证： 本研究提供了首个体内证据（小鼠模型），证明 PSS 可以抑制结肠恶性生长，验证了其作为治疗候选药物的潜力。

意义与主张
作者声称 PSS 混合物具有作为癌症疗法的潜在临床价值，特别是针对结直肠癌和前列腺癌。研究结论认为 PSS 通过直接细胞毒性和 TAM 调节成功抑制了癌细胞增殖。然而，作者在关于立即临床应用方面保持了谨慎的态度。他们明确指出：

• 研究结果属于“概念验证”。
• 需要对底层机制（超出测试的三种基因之外）和药代动力学进行进一步研究。
• 目前体内的浓度受限于溶解度，若要实现临床转化，需要更高浓度或不同的给药途径（口服/静脉注射）。
• 在进行进一步研究之前，这些提取物尚不能作为草药口服疗法或补充剂使用。
• 研究承认了一些局限性，包括使用的是永生化细胞系（HEK 293、THP-1）而非原代正常细胞，以及缺乏与标准化学疗法的联合治疗测试。

论文强调，尽管 PSS 显示出前景，但其功效在不同癌症类型或遗传背景下并不统一，且其应用需要仔细考虑剂量和患者特异性因素。