Combination of the extract from Phellinus linteus with Smilax spp. attenuates colorectal and prostate cancers

技術要約：Phellinus linteus（カワラタケ）とSmilax属（サンショウモドキ属）の組み合わせによる大腸癌および前立腺癌の減衰

問題提起
従来の癌治療（手術、化学療法、ホルモン療法）が存在するにもかかわらず、死亡率や治療による副作用は依然として高い。生存率を向上させ毒性を軽減するための補助療法として、天然化合物への関心が高まっている。伝統的なタイの薬草、特にPhellinus linteus（PL、薬用キノコ）およびSmilax属（具体的にはSmilax corbulariaおよびSmilax glabra、これらをPLと組み合わせたものを総称してPSSと呼ぶ）は、歴史的に癌治療に使用されてきたが、それらの具体的なメカニズムや大腸癌および前立腺癌に対する有効性は、厳密な科学的検証を必要としている。これらの薬草に関する先行研究は、乳癌に限定されているか、あるいは免疫調節やin vivoでのトランスレーショナルな可能性を十分に探求することなく、in vitroでの共培養に大きく依存していた。

方法論
本研究では、in vitro細胞培養、分子解析、免疫細胞調節アッセイ、およびin vivo異種移植モデルを組み合わせた多角的なアプローチを採用した。

• 細胞株： 本研究では、3種類の大腸癌細胞株（HCT116、SW620、HT-29）、1種類の前立腺癌細胞株（PC3）、および毒性とメカニズム研究のための非癌性腎細胞株（HEK 293）を利用した。マクロファージはTHP-1単球系細胞から誘導した。
• 抽出物の調製： 蒸留水を用いて、PLの子実体とSmilax属の根茎を3:1:1の比率で抽出することにより、混合物（PSS）を調製した。純粋なPL抽出物も別途調製した。
• 細胞毒性と細胞周期： IC50値を決定するためにMTTアッセイを通じて細胞毒性を評価した。細胞周期分布は、プロピジウムイオダイド（PI）染色を用いたフローサイトメトリーを用いて分析した。アポトーシスはAnnexin V/PI染色を用いて評価した。
• 遺伝子発現： 増殖に関連する遺伝子（MDM2、KRAS、MKI67）の発現を分析するためにRT-qPCRを実施した。
• 免疫調節（TAMs）： HCT116のコンディショニング培地を用いて腫瘍関連マクロファージ（TAM）を誘導した。抽出物がTAMの極性化（M1型 vs M2型）、サイトカイン分泌（TNF-α、IL-6、IL-10）、および腫瘍殺傷能（CFSE標識された癌細胞との共培養により測定）に及ぼす影響を評価した。
• In Vivo モデル： HCT116細胞を用いた雄性ヌードマウス（BALB/c）の皮下異種移植モデルを確立した。マウスに対し、腫瘍接種から2週間後に、PL、PSS、または生理食塩水を病変内注射した。腫瘍体積と体重を30日間にわたってモニタリングした。

主な結果

• 細胞毒性： PLおよびPSSの両方が、大腸癌および前立腺癌細胞株に対して用量依存的な細胞毒性を示した。PSSは、PL単独よりも強い抗腫瘍効果（より低いIC50値）を示した。PSSはSW620細胞に対して最も毒性が強く、HEK 293細胞に対しては最も毒性が低かった。シスプラチンは全体として最も強力な薬剤であった。
• 細胞周期とアポトーシス： PSSはすべての大腸癌細胞株において効果的にG2期細胞周期停止を誘導したが、PC3細胞には停止させなかった。PLはHT-29およびSW620においてのみG2期停止を誘導した。両抽出物は、シスプラチンと比較して低いアポトーシス率（<5%）を誘導した。
• 遺伝子発現： 両抽出物は、すべての癌細胞種においてMDM2の発現を減少させた。MKI67の発現は、両抽出物によってHCT116、HT-29、およびPC3において減少した。KRASの発現は、可変的な反応を示した。すなわち、HT-29およびPC3ではダウンレギュレーションされたが、HCT116ではアップレギュレーションされ、SW620では変化しなかった。
• 免疫調節： 癌コンディショニング培地は、M2様のマクロファージ極性化を誘導した（Fizz-1、TGF-β、Arg-1、IL-6、IL-10の上昇、およびIL-1β、iNOS、TNF-αの低下）。PLおよびPSSの両方が、M1マーカー（IL-1β、iNOS）をアップレギュレートし、M2マーカーをダウンレギュレートすることで、この傾向を逆転させた。しかし、PSSのみが有意にArg-1の発現を減少させ、CFSE染色された癌細胞との共培養アッセイにおいて腫瘍殺傷効果を示した。
• In Vivo 有効性： マウス異種移植モデルにおいて、PSSの投与はHCT116注入マウスの腫瘍体積を有意に減衰させた。PLの投与は、溶解性の制限により効果的な濃度を使用できなかったため、腫瘍体積の有意な減少を示さなかった。

主要な貢献

1. 比較有効性： 本研究は、Phellinus linteusとSmilax属の組み合わせ（PSS）が、in vitroにおける大腸癌および前立腺癌細胞の増殖抑制、およびin vivoにおける腫瘍増殖の減衰において、PL単独よりも効果的であることを確立した。
2. メカニズムの洞察： 本研究は、PSSの抗腫瘍メカニズムが、直接的な細胞毒性（G2停止）と、腫瘍微小環境の調節（特に、プロ腫瘍性のM2表現型から抗腫瘍性のM1表現型へのマクロファージ極性の転換）を含むことを特定した。
3. 遺伝子と表現型の相関： 本研究は、PSSの細胞毒性が、すべての細胞株においてMDM2やKRASといった特定の遺伝子のダウンレギュレーションと厳密には相関しないことを強調しており、これは特定のp53やKRASの変異状態に依存しないマルチターゲットなメカニズムを示唆している。
4. トランスレーショナルな概念実証： 本研究は、PSSが大腸癌の増殖を抑制できるという最初のin vivoエビデンス（マウスモデル）を提供し、治療候補としての可能性を検証した。

意義および主張
著者らは、PSS混合物が、特に大腸癌および前立腺癌に対して臨床的価値を持つ可能性があると主張している。本研究は、PSSが直接的な細胞毒性とTAM調節を通じて癌細胞の増殖を抑制することに成功したと結論付けている。しかし、著者らは即時の臨床応用については慎重な姿勢を維持している。彼らは以下のことを明示している：

• これらの知見は「概念実証（プルーフ・オブ・コンセプト）」であること。
• （テストされた3つの遺伝子を超えた）基礎となるメカニズムおよび薬物動態に関するさらなる調査が必要であること。
• 現在のin vivo濃度は溶解性に制限されており、臨床へのトランスレーションには、より高い濃度または異なる投与経路（経口または静脈内）が必要であること。
• 抽出物は、さらなる研究なしに、薬草としての経口療法やサプリメントとして使用できる段階にはないこと。
• 本研究は、不死化細胞株（HEK 293、THP-1）の使用や、標準的な化学療法との併用療法のテストの欠如といった限界を認めている。

本論文は、PSSは有望ではあるものの、その有効性はすべての癌種や遺伝的背景において一様ではなく、その適用には用量や患者固有の要因を慎重に検討する必要があることを強調している。