Identification and applicability of azg1 as counter-selectable marker in Trichoderma species
本研究将内源基因 *azg1* 确立为一种多功能的反向选择标记，并通过利用 CRISPR/Cas9 介导的 8-氮杂鸟嘌呤摄取破坏以及对 5-氟胞嘧啶的异源敏感化，扩展了通过高效靶向整合与工程化改造进行木霉属物种遗传工具箱的范围。
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真菌是这个世界中看不见的工程师，它们分解死亡的物质，哺育植物，有时还能对抗疾病。在这些真菌中，被称为“木霉属”（Trichoderma）的一类真菌赢得了特殊的声誉。这些微小的生物是其他真菌的天敌，使它们成为那些希望在不使用烈性化学品的情况下保护农作物的农民手中的宝贵工具。它们也是工业领域的佼佼者，通过产生酶来帮助将木材转化为纸张或生物燃料。为了充分利用这些有益真菌，科学家需要深入了解它们的生物学特性，这通常需要重写它们的遗传密码。然而，编辑木霉属的 DNA 出人意料地困难。与一些研究较深入的其他真菌不同，木霉属物种天生极其顽强。它们已经进化到能在浸泡在农业化学品中的土壤中生存，这意味着它们经常会忽略科学家在实验室中用来控制它们的标准“停止”信号。这种抗性使得插入新基因或移除旧基因变得困难，导致研究人员用于研究或改良这些生物的工具非常有限。
奥地利因斯布鲁克大学的一个研究小组现在找到了一种绕过这种顽固性的方法。他们发现了一种存在于木霉属内部的特定遗传开关，可以通过关闭该开关使真菌对一种无害化学物质变得敏感，然后再将其重新开启以进行精确的基因编辑。成功的关键是一种名为 8-azaguanine 的化合物。在自然状态下，这种真菌对该物质具有免疫力。但研究人员鉴定出了一个名为 azg1 的基因，它就像一扇门，允许这种化学物质进入细胞。当这扇门打开时，化学物质进入并停止真菌生长。研究团队使用一种现代基因编辑工具“砰”地一声关上了这扇门——即删除了 azg1 基因。结果是，得到的真菌菌株无法让这种化学物质进入，从而对这种毒素完全免疫。这种免疫性成为了研究人员的新型筛选工具。通过在含有该化学物质的培养皿中培养真菌，他们可以确定任何存活下来的真菌都已成功移除了其 azg1 基因。
掌握了这种新方法后，科学家们展示了他们可以将被删除基因留下的空白空间作为精确的“对接站”，来接收新的遗传指令。他们在该位置插入了一种发绿光的蛋白质，真菌随之亮了起来，证明了新基因准确地降落在他们想要的位置。这种方法比以往的方法要灵活得多，因为以往的方法通常依赖于添加只能使用一次的抗生素抗性基因。在这里，研究人员可以移除 azgi 基因，插入一个新工具，然后有可能再次利用同一个位置进行另一次实验。他们不仅在主要模型木霉属 atrviride 上测试了这一系统，还在包括以工业用途闻名的里氏木霉（Trichoderma reesei）在内的几种相关物种上进行了测试。在每种情况下，该策略都奏效了，这表明这种遗传“对接端口”是整个木霉属的一个普遍特征。
团队并未止步于证明该方法有效；他们还利用它构建了真菌的新功能。首先，他们尝试让真菌对另一种通常会被其忽略的化学物质——5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine）产生敏感性。他们插入了一个来自另一种真菌的基因，这个基因像一把钥匙，解锁了处理这种化学物质的能力。一旦安装了这个新基因，木霉属就变得对该化学物质脆弱，从而为第二种类型的遗传筛选打开了大门。接下来，他们测试了一个允许科学家像控制灯光开关一样控制基因开关的系统，使用的是一种常见的抗生素——多西环素（doxycycline）。通过将这个开关放入他们的新遗传对接站中，他们成功创造出了一种亮度会根据添加到食物中的抗生素量而变亮或变暗的真菌。最后，他们安装了多种颜色的荧光蛋白，为研究人员在显微镜下追踪真菌的运动和结构提供了全新的色彩调色盘。
这项工作代表了研究有益真菌的重要进展。通过识别真菌防御系统中的一个自然弱点并将其转化为工具，研究人员为编辑木霉属的基因组提供了一种可靠、可重复且温和的方法。研究结果表明，azg1 基因不仅是一个筛选目标，还是基因组中的一个中性位点，可以在不损害真菌自然能力的情况下添加新性状。在进行这些改变后，真菌继续生长、对抗其他微生物并对环境做出反应，表现得与之前完全一致。这种稳定性对于旨在用于农业或工业的任何生物体来说都至关重要。研究人员展示了该系统在多个物种中均有效，为此前缺失的工程化木霉属的标准方法提供了支持。虽然还需要更多的测试来观察其在复杂的现实环境中的表现，但这项研究为未来的基因工程奠定了坚实的基础，有望带来更好的作物生物防治手段和更高效的工业流程。
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