Identification and applicability of azg1 as counter-selectable marker in Trichoderma species
本研究は、内因性遺伝子*azg1*を多才なカウンター選択マーカーとして確立し、8-アザグアニンの取り込みの破壊および5-フルオロシトシンの異種感受性化を通じたCRISPR/Cas9による効率的な標的統合とエンジニアリングを可能にすることで、トリコデルマ属菌の遺伝学的ツールキットを拡張するものである。
原論文は CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) でライセンスされています。 これは査読を受けていないプレプリントのAI生成解説です。医学的助言ではありません。この内容に基づいて健康上の判断をしないでください。 免責事項の全文を読む
真菌は、死骸を分解し、植物に栄養を与え、時には病気と戦うという、私たちの世界の目に見えないエンジニアです。その中でも、「トリコデルマ（Trichoderma）」と呼ばれるグループは特別な名声を得ています。これらの微小な生物は他の真菌の天然の捕食者であり、化学薬品を使わずに作物を守りたい農家にとって貴重なツールとなっています。また、彼らは産業界の強力な推進力でもあり、木材を紙やバイオ燃料へと変えるための酵素を大量に作り出します。これらの有益な真菌を最大限に活用するために、科学者たちはその生物学を深く理解する必要があり、それはしばしば遺伝暗号を書き換えることを要求します。しかし、トリコデルマのDNAを編集することは、驚くほど困難でした。よく研究されている他の真菌とは異なり、トリコデルマ属の種は自然界において非常に「タフ」です。彼らは農業用化学薬品が染み込んだ土壌の中で生き残るよう進化してきたため、研究者がラボで制御するために使用する標準的な「停止」信号をしばしば無視してしまうのです。この耐性が、新しい遺伝子を挿入したり古い遺伝子を取り除いたりすることを難しくしており、研究者がこれらの生物を研究したり改良したりするための道具を限定的なものにしています。
オーストリアのインスブルック大学の研究チームは、この頑固さを回避する方法を見出しました。彼らは、トリコデルマの中に、特定の遺伝的スイッチが存在し、それをオフにすることで真菌を無害な化学物質に対して感受性を持たせ、その後オンに戻すことで精密な遺伝子編集を可能にすることを発見しました。成功の鍵となったのは、8-アザグアニンと呼ばれる化合物でした。自然な状態では、真菌はこの物質に対して免疫を持っています。しかし、研究者たちは、細胞内に化学物質を招き入れる「ドア」として機能する、azg1 と名付けられた特定の遺伝子を特定しました。このドアが開いているとき、化学物質が中に入り込み、真菌の成長を止めます。チームは現代的な遺伝子編集ツールを使用して、このドアを「閉める」ために azg1 遺伝子を欠損させることで、このドアを力強く閉め切りました。その結果、この真菌は化学物質を中に入れることができなくなり、完全にその毒に対する免疫を獲得しました。この免疫が、研究者たちの新しい選択ツールとなったのです。化学物質を含むプレート上で真菌を育てることで、生存した真菌はすべて azg1 遺伝子が正常に除去されたものであると確信できるようになったのです。
この新しい手法を手にした研究者たちは、削除された遺伝子が残した空きスペースを、新しい遺伝的指示のための精密なドッキングステーションとして利用できることを実証しました。彼らはこの場所に光る緑色のタンパク質を挿入し、真菌が光り輝いたことで、新しい遺伝子がまさに意図した場所に着地したことを証明しました。このアプローチは、一度しか使えない抗生物質耐性遺伝子の追加に頼りがちだった従来のメソッドよりも、はるかに柔軟です。ここでは、研究者は azg1 遺伝子を取り除き、新しいツールを挿入し、その後、同じ場所を別の実験のために再び利用することができます。彼らはこのシステムを、主要なモデルである Trichoderma atroviride だけでなく、産業利用で有名な Trichoderma reesei を含む、関連する他の数種のトリコデルマに対してもテストしました。すべてのケースで戦略は機能し、この「ドッキングポート」がトリコデルマ属全体における普遍的な特徴であることを示唆しました。
チームは、この方法が機能することを証明するだけでなく、真菌に新しい能力を構築することにも取り組みました。まず、通常は無視する別の化学物質である5-フルオロシトシンに対して、真菌を感受性を持たせる試みを行いました。彼らは、この化学物質を処理する能力の「鍵」として機能する、異なる種類の真菌由来の遺伝子を挿入しました。この新しい遺伝子がインストールされると、トリコデルマは化学物質に対して脆弱になり、二番目のタイプの遺伝的選択への扉が開かれました。次に、彼らは一般的な抗生物質であるドキシサイクリンを使用して、遺伝子のオン・オフをライトスイッチのように切り替えるシステムをテストしました。このスイッチを新しい遺伝的ドッキングステーションに配置することで、彼らは、餌に添加される抗生物質の量に応じて光の強さが変わる真菌の作成に成功しました。最後に、いくつかの異なる色の光るタンパク質を設置し、顕微鏡下で真菌の動きや構造を追跡するための新しいカラーパレットを研究者に提供しました。
この研究は、有益な真菌の研究における重要な前進を意味しています。真菌の防御システムの自然な弱点を見出し、それをツールに変えることで、研究者たちは、トリコデルマのゲノムを信頼性が高く、再利用可能で、かつ穏やかな方法で編集する手段を提供しました。これらの知見は、azg1 遺伝子が単なる選択のターゲットではなく、真菌の自然な能力を損なうことなく新しい形質を追加できる、ゲノム内のニュートラルな地点であることを示唆しています。真菌は、変更が加えられた後も、以前と全く同じように成長し、他の微生物と戦い、環境に反応し続けました。この安定性は、農業や産業で使用される生物にとって極めて重要です。研究者たちは、このシステムが複数の種にわたって機能することを示し、これまで欠けていた、これらの生物を設計するための標準化された方法を提示しました。複雑な現実世界の環境でどの程度維持されるかについてはさらなるテストが必要ですが、この研究は、より優れた作物用生物学的防除や、より効率的な産業プロセスにつながる可能性のある、遺伝子工学の強固な基礎を築いています。
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