Identification and applicability of azg1 as counter-selectable marker in Trichoderma species

Schimmels zijn de onzichtbare ingenieurs van onze wereld; ze breken dood materiaal af, voeden planten en bestrijden soms ziekten. Onder hen heeft een groep genaamd Trichoderma een speciale reputatie opgebouwd. Deze microscopische organismen zijn natuurlijke roofdieren van andere schimmels, wat hen waardevolle instrumenten maakt voor boeren die gewassen willen beschermen zonder harde chemicaliën te gebruiken. Ze zijn ook industriële krachtpatsers die enzymen produceren die helpen bij het omzetten van hout in papier of biobrandstof. Om het meeste uit deze nuttige schimmels te halen, moeten wetenschappers hun biologie diepgaand begrijpen, wat vaak vereist dat ze hun genetische code herschrijven. Het bewerken van het DNA van Trichoderma is echter verrassend moeilijk gebleken. In tegenstelling tot sommige andere goed bestudeerde schimmels, zijn Trichoderma-soorten van nature taai. Ze zijn geëvolueerd om te overleven in bodems die doordrenkt zijn met landbouwchemicaliën, wat betekent dat ze de standaard "stop"-signalen die wetenschappers in het laboratorium gebruiken om hen te controleren, vaak negeren. Deze resistentie maakt het moeilijk om nieuwe genen in te voegen of oude te verwijderen, waardoor onderzoekers beperkt zijn in hun gereedschap om deze organismen te bestuderen of te verbeteren.

Een team onderzoekers aan de Universiteit van Innsbruck in Oostenrijk heeft nu een manier gevonden om deze eigenwijsheid te omzeilen. Ze ontdekten een specifieke genetische schakelaar binnen Trichoderma die kan worden uitgezet om de schimmel gevoelig te maken voor een onschadelijke chemische stof, en vervolgens weer kan worden aangezet om nauwkeurige genetische bewerking mogelijk te maken. De sleutel tot hun succes was een verbinding genaamd 8-azaguanine. In haar natuurlijke staat is de schimmel immuun voor deze stof. Maar de onderzoekers identificeerden een gen, dat ze het azg1-gen noemden, dat werkt als een deur die de chemische stof de cel in laat. Wanneer deze deur openstaat, komt de chemische stof binnen en stopt de groei van de schimmel. Het team gebruikte een moderne gen-bewerkingsmethode om deze deur dicht te slaan door het azg1-gen te verwijderen. Het resultaat was een stam schimmel die de chemische stof niet langer kon binnenlaten, waardoor de schimmel volledig immuun werd voor het gif. Deze immuniteit werd de nieuwe selectiemethode van de onderzoekers. Door de schimmel te kweken op een plaat met de chemische stof, konden zij er zeker van zijn dat elke schimmel die overleefde, het azg1-gen succesvol had verwijderd.

Met deze nieuwe methode in handen demonstreerden de wetenschappers dat ze de lege ruimte die achterblijft door het verwijderde gen kunnen gebruiken als een nauwkeurig dokstation voor nieuwe genetische instructies. Ze voegden een lichtgevend groen eiwit in op deze plek, en de schimmel lichtte op, wat bewees dat het nieuwe gen precies landde waar zij het wilden hebben. Deze aanpak is veel flexibeler dan eerdere methoden, die vaak vertrouwden op het toevoegen van antibiotica-resistentiegenen die slechts één keer gebruikt konden worden. Hier konden de onderzoekers het azg1-gen verwijderen, een nieuw instrument invoegen en vervolgens potentieel dezelfde plek weer gebruiken voor een ander experiment. Ze testten dit systeem niet alleen op hun primaire model, Trichoderma atroviride, maar ook op verschillende andere verwante soorten, waaronder Trichoderma reesei, die beroemd is om zijn industriële gebruik. In elk geval werkte de strategie, wat suggereert dat deze genetische "docking port" een universeel kenmerk is binnen het genus.

Het team stopte niet bij het bewijzen dat de methode werkte; ze gebruikten het om nieuwe capaciteiten aan de schimmel toe te voegen. Eerst probeerden ze de schimmel gevoelig te maken voor een andere chemische stof, 5-fluorocytosine, die de schimmel normaal gesproken negeert. Ze voegden een gen toe van een ander type schimmel dat werkt als een sleutel, waardoor het vermogen wordt ontgrendeld om deze chemische stof te verwerken. Zodra dit nieuwe gen was geïnstalleerd, werd de Trichoderma kwetsbaar voor de chemische stof, wat de deur opende voor een tweede type genetische selectie. Vervolgens testten ze een systeem waarmee wetenschappers genen aan en uit kunnen zetten als een lichtschakelaar met behulp van een veelgebruikte antibioticum genaamd doxycycline. Door deze schakelaar in hun nieuwe genetische dokstation te plaatsen, creëerden ze succesvol een schimmel die feller of doffer straalt afhankelijk van hoeveel antibioticum er aan het voedsel wordt toegevoegd. Ten slotte installeerden ze verschillende gekleurde lichtgevende eiwitten, waardoor de onderzoekers een nieuw palet aan kleuren kregen om de bewegingen en structuren van de schimmel onder een microscoop te volgen.

Dit werk vormt een belangrijke stap voorwaarts in het onderzoek naar gunstige schimmels. Door een natuurlijke zwakte in het verdedigingssysteem van de schimmel te identificeren en deze in een hulpmiddel te veranderen, hebben de onderzoekers een betrouwbare, herbruikbare en milde manier geboden om het genoom van Trichoderma te bewerken. De bevindingen suggereren dat het azg1-gen niet alleen een doelwit is voor selectie, maar een neutrale plek in het genoom waar nieuwe eigenschappen kunnen worden toegevoegd zonder de natuurlijke vermogens van de schimmel aan te tasten. De schimmel bleef groeien, bestrijden andere microben en reageren op de omgeving precies zoals voorheen, na de wijzigingen. Deze stabiliteit is cruciaal voor elk organisme dat bedoeld is voor gebruik in de landbouw of industrie. De onderzoekers toonden aan dat dit systeem werkt over meerdere soorten, wat een gestandaardiseerde manier biedt om deze organismen te modificeren die voorheen ontbrak. Hoewel er meer testen nodig zijn om te zien hoe goed dit standhoudt in complexe, reële omgevingen, legt de studie een solide fundament voor toekomstige genetische manipulatie, wat potentieel kan leiden tot betere biologische bestrijding van gewassen en efficiëntere industriële processen.