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A Rapid and Cost-Effective Flow Cytometry Method for Detecting Air Inoculum of Botrytis cinerea and Aspergillus carbonarius in Vineyards

本研究提出了一种快速、低成本且环境友好型的流式细胞术方法，该方法能够成功地从葡萄园空气样本中将 Botrytis cinerea 和 Aspergillus carbonarius 的空气分生孢子与其他真菌物种区分开来，为早期检测和及时干预以减轻果穗腐烂及霉菌毒素风险提供了一种极具前景的工具。

原作者： Emanuele Chiaromonte, Angelo Agnusdei, Fabio Mavelli, Franco Nigro, Francesco Faretra, Emiliano Altamura, Stefania Pollastro

发布于 2026-09-30

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CC BY 4.0

原作者： Emanuele Chiaromonte, Angelo Agnusdei, Fabio Mavelli, Franco Nigro, Francesco Faretra, Emiliano Altamura, Stefania Pollastro

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ✨ 这是对下方论文的AI生成解释。它不是由作者撰写或认可的。如需技术准确性，请参阅原始论文。阅读完整免责声明

在葡萄园静谧的行间，一场关乎收获未来的战斗已经在肉眼看不见的地方悄然展开。空气中充满了微小的孢子，这些真菌的繁殖单位能在短短几天内就让健康的葡萄串变成腐烂的团块。其中两种最危险的入侵者分别是引起导致食用葡萄变质的灰霉病菌（Botrytis cinerea），以及一种不仅会使果实腐烂，还会产生一种名为赭曲霉毒素 A（ochratoxin A）的有毒物质的真菌——赭曲霉（Aspergillus carbonarius），这种污染物对人类健康构成严重威胁。对于农民和科学家而言，了解这些孢子何时出现在空气中至关重要。这能让他们预测疫情爆发，并在损害发生前对葡萄藤进行处理。传统上，识别这些隐形的旅行者是一个缓慢且耗费人力的过程。科学家们会将孢子收集在粘性胶带或过滤器上，然后花费数小时盯着显微镜，试图将一个微小且通常呈半透明状的形状与另一个区分开来。这种方法高度依赖观察者的技术，且可能需要数天才能得出结果，往往会错过早期干预的关键窗口期。

意大利巴里阿尔多·莫罗大学（University of Bari Aldo Moro）的一个研究小组开发了一种观察这些孢子的新方法，它更快、更便宜，且对人眼的依赖程度更低。他们采用了流式细胞术（flow cytometry）技术，这是一种通常用于医学实验室计数血细胞或分类不同类型细胞的方法。在这项研究中，研究人员改装了该机器，用以分析来自葡萄园的空气样本。该机器并非通过透镜逐一观察孢子，而是将空气样本悬浮在水流中，并使其经过激光束。当每个孢子经过光束时，它会根据其大小和内部复杂程度产生独特的散射模式。该机器还使用一种无害的荧光染料，这种染料会附着在真菌细胞壁的几丁质（chitin）上，使孢子发出荧光。通过测量光的散射程度和孢子发光的亮度，机器可以为每种类型的真菌创建数字指纹。

研究人员利用目标真菌的纯培养物，以及葡萄园中常见的其他真菌（如青霉属 Penicillium 和克拉多孢霉属 Cladosporium）对这种方法进行了测试。他们发现，机器可以清晰地将灰霉菌（Botrytis cinerea）和赭曲霉（Aspergillus carbonarius）的孢子从人群中分离出来。这两种危险物种具有独特的特征，不会与无害的背景噪声或其他常见真菌重叠。该系统非常精确，即使研究人员将所有不同的孢子混合在一个样本中，机器仍能以极低的错误率识别出特定的目标。对于灰霉菌，机器将另一种孢子误认为该真菌的概率低于百分之二。对于赭曲霉，错误率保持在较低水平，通常低于百分之五。即使在研究人员测试从真实葡萄园采集的空气样本（其中孢子与尘埃和其他环境碎屑混合在一起）时，这种准确度依然成立。

然而，这种方法并非对每一种真菌都灵验。研究人员发现，某些物种（如克拉多孢霉属 Cladosporium 和青霉属 Penicillium）在机器看来过于相似，无法可靠地进行区分。在这些情况下，孢子的数据重叠过多，导致机器无法辨别它们。同样，交链孢菌（Alternaria alternata）的孢子在外观上过于多变，无法被确定地识别，因为它们会混入空气中的非生物颗粒中。尽管存在这些局限性，但研究证明，该技术对于这两种经济破坏力最大的病原体非常有效。当研究人员将机器的计数与传统方法进行比较时，结果高度吻合。流式细胞术的计数与实验室培养皿中生长的真菌菌落数量密切相关，并且也与统计真菌 DNA 的基因检测结果高度一致。

这项工作对葡萄园管理的未来具有重要意义。这种新方法每小时最多可处理 60 个样本，这一速度是人工显微镜无法实现的。它不需要有毒化学品，也不需要复杂的 DNA 提取过程，使其成为频繁监测的实用工具。通过提供快速、可靠的空气中危险孢子的计数，这项技术可以让农民在检测到风险时立即采取行动，而不是等待数天的实验室报告。这种向实时数据转变的方式有助于减少杀菌剂的使用，实现精准治疗，并可能在防止葡萄和葡萄酒中积累毒素方面发挥至关重要的作用。研究表明，虽然流式细胞术可能无法取代每一种现有方法，但它为高科技分析与保护收成的日常需求之间提供了一个强大且高效的桥梁。

技术摘要：一种用于检测葡萄园中黑刺孢菌（Botrytis cinerea）和黑曲孢菌（Aspergillus carbonarius）空气孢子载量的快速且具成本效益的流式细胞术方法

问题陈述
由植物病原真菌黑刺孢菌（Botrytis cinerea，即灰霉病）和黑曲孢菌（Aspergillus carbonarius）引起的果穗腐烂，对葡萄生产构成了重大威胁，并因 Ochratoxin A (OTA) 等霉菌毒素污染带来了食品安全风险。虽然监测空气传播的分生孢子对于疾病预测和综合害虫管理至关重要，但目前的诊断方法——包括显微镜检查、基于培养的技术以及分子检测（PCR/qPCR）——都存在局限性。显微镜检查依赖于操作人员且通量较低；培养法过程缓慢，且受选择性生长条件的限制；而分子技术则需要复杂的核酸提取和专门的基础设施，限制了其在葡萄园环境中进行高频、近实时监测的实用性。

方法论
本研究开发了一种基于形态学的流式细胞术方案，用于从环境污染物和其他非目标真菌物种中区分空气传播的黑曲孢菌和黑刺孢菌分生孢子。

样品制备： 从目标物种（黑曲孢菌、黑刺孢菌）及常见葡萄园污染物（黑枝孢菌 A. alternata、黑曲霉 A. niger、克拉多孢菌属 Cladosporium sp.、青霉菌 Penicillium expansum）的纯培养物中制备分生孢子悬浮液。使用钙黄素白（Calcofluor White）对孢子进行染色，以结合真菌细胞壁中的几丁质，从而增强荧光检测。
仪器分析： 使用 BD LSRFortessa X-20 流式细胞仪进行分析。参数包括用于衡量大小和内部复杂度的前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A），以及来自钙黄素白染料的荧光信号（405 nm 激发，450 ± 25 nm 发射）。
门控策略： 基于纯培养物特征建立物种特异性门控，以捕获至少 60% 的目标事件。这些门控通过了混合悬浮液和野外采集的空气样本（通过 0.2 µm 尼龙膜过滤器收集）的验证。
验证： 流式细胞术结果通过以下方式进行了交叉验证：
1. 生物学方法： 在麦芽提取琼脂（MEA）上进行基于培养的定量（CFU/mL）。
2. 分子方法： 针对黑曲孢菌的物种特异性 qPCR。
3. 统计分析： 计算了不同方法之间的相关系数 ( $R^2$ )。

关键结果

辨别能力： 该方法能够根据散射和荧光特征，成功且可靠地将黑刺孢菌和黑曲孢菌从其他物种中区分出来。
- 黑刺孢菌与其它物种的分离非常彻底，误分类率接近于零（与黑曲孢菌的重叠率最大仅为 2%）。
- 黑曲孢菌具有可辨别性，误分类率较低（对大多数物种 <5%）。
特异性局限：
- 克拉多孢菌属（Cladosporium sp.）和青霉菌（P. expansum）表现出显著的形态学重叠，导致两者之间存在较高的相互误分类率（分别为 41.5% 和 43%），无法实现可靠的区分。
- 由于与非特异性背景事件和碎屑存在显著重叠，黑枝孢菌（A. alternata）无法被准确辨别。
- 黑曲霉（A. niger）在纯培养物门控与环境样本检测之间存在差异，这可能是由于自然环境下黑曲霉黑曲霉节段（Aspergillus section Nigri complex）的高度异质性所致。
验证相关性：
- 在黑刺孢菌的流式细胞术事件计数与基于培养的 CFU 计数之间观察到强正相关（ $R^2 = 0.96$ ），以及黑曲孢菌的强正相关（ $R^2 = 0.89$ ）。
- qPCR 结果与黑曲孢菌的流式细胞术计数之间存在显著相关性（ $R^2 = 0.75$ ）。
- 在自然污染的空气样本中，该方法检测到的目标物种与生物学和分子验证结果一致，尽管青霉菌和克拉多孢菌仍是主要的培养群体。

意义与主张
作者认为，这种流式细胞术方法为分析空气样本提供了一种快速、成本效益高且环保的替代方案，每小时可处理多达 60 个样本。该研究声称，该方法通过以下方式弥补了高通量分析技术与实际空气生物学监测之间的差距：

缩短操作时间： 消除了培养法所需的漫长孵育期以及分子检测所需的核酸提取步骤。
减少试剂使用： 在操作过程中无需使用有害或污染环境的试剂。
实现及时干预： 提供一种早期检测空气传播孢子的工具，从而支持数据驱动的疾病预测和针对性的杀菌剂施用。

论文审慎地总结道，虽然该方法对于具有特定且分类学特征明显的病原体（如黑刺孢菌和黑曲孢菌）非常有效，但其最适合作为一种针对性的检测工具，而非全面的真菌群落谱分析方法。作者指出，对于形态相似的物种，可能需要额外的标记或分子确认。作者认为，这项技术是整合进常规葡萄园监测系统，以减轻果穗腐烂和 OTA 污染风险的一个极具前景的策略。

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