A FRET Ligation Assay using Fluorescent Proteins for Bacterial Sortase Enzymes

في العالم المجهري للبكتيريا، يوجد أداة جزيئية متخصصة تُعرف باسم إنزيم السورتيز (sortase). فكر في هذا الإنزيم كأنه مقص جزيئي وزوج من الغراء مدمجين معاً. وظيفته الطبيعية هي التعرف على تسلسل محدد من وحدات البناء داخل البروتين، ثم قطع ذلك التسلسل، ومن ثم لصق قطعة جديدة فوراً في الطرف المقطوع. لقد تعلم العلماء تسخير هذه القدرة لتقنية تسمى "الربط بوساطة السورتيز" (sortase-mediated ligation)، وهي طريقة تُستخدم لخياطة بروتينات مختلفة معاً لإنشاء أدوية ولقاحات وأدوات تشخيصية جديدة. وتأتي النسخة الأكثر شيوعاً من هذا الإنزيم من بكتيريا تُسمى "المكورات العنقودية الذهبية" (Staphylococcus aureus)، ولكن حتى هذه الأداة واسعة الاستخدام لها حدود؛ فهي ليست فعالة دائماً، وتتطلب أن تحتوي قطع البروتين التي تجمعها على نمط محدد جداً وصلب من الأحماض الأمينية لكي تعمل على الإطلاق. وبسبب هذه القيود، يبحث الباحثون باستمرار عن نسخ أفضل من الإنزيم وطرق جديدة لاختبارها بسرعة ودقة.

ولحل مشكلة إيجاد إنزيمات أفضل واختبار أنماط بروتينية مختلفة، طور فريق من الباحثين طريقة جديدة لمراقبة عملية الربط وهي تحدث في الوقت الفعلي. فبدلاً من التخمين عما إذا كان الإنزيم قد نجح في لصق قطعتين بروتينيتين معاً، قاموا بإرفاق بروتينين متوهجين مختلفين بنهايات القطع التي أرادوا دمجها. أحد هذين البروتينين المتوهجين هو درجة من اللون الأزرق المخضر، والآخر هو لون أصفر ساطع. وعندما تكون هاتان البروتينان بعيدتين عن بعضهما، فإنهما تتوهجان بشكل مستقل. ومع ذلك، عندما ينجح إنزيم السورتيز في أداء مهمته ويربط قطعتي البروتين معاً، تُجبر البروتينات المتوهجة على الاقتراب بما يكفي لنقل الطاقة بينهما. ويؤدي هذا الانتقال إلى خفوت التوهج الأزرق المخضر وزيادة سطوع التوهج الأصفر، مما يعمل بمثابة مفتاح ضوئي يشير إلى حدوث التفاعل. وقد استخدم الباحثون بروتينات متوهجة محددة تُعرف باسم mTurquoise2 وSYFP2 لإنشاء هذه الإشارة المرئية.

ركزت الدراسة على تحسين هذا الاختبار المتوه لجعله أداة موثوقة للفحص. وأظهر الباحثون أنه من خلال تغيير ترتيب القطع البروتينية، يمكنهم استخدام هذا النظام القائم على الضوء لاختبار أجزاء مختلفة من التفاعل. كما أوضحوا أنه يمكن استخدام هذا الاختبار للتحقق من مدى قدرة الإنزيم على التعرف على أنماط بداية مختلفة، ومدى قبوله لقطع ثانية مختلفة لإلحاقها، وحتى مدى فعالية النسخ الجديدة المهندسة من الإنزيم نفسه. ويشير هذا العمل إلى أن هذه الطريقة توفر وسيلة واضحة ومباشة لمراقبة تكوين المنتج النهائي دون الحاجة إلى خطوات كيميائية معقدة. وبينما تقدم الورقة البحثية هذا كـ "إثبات للمفهوم"، مما يشير إلى أن الطريقة تعمل في بيئة مختبرية، فقد لاحظ المؤلفون أن المزيد من التحسين سيكون ضرورياً لجعلها مناسبة للفحص عالي الإنتاجية، حيث يمكن اختبار آلاف المتغيرات المختلفة من الإنزيم بسرعة. ويقدم هذا النهج مساراً واعداً لتطوير أدوات أكثر كفاءة لبناء هياكل بروتينية معقدة للاستخدام الطبي والعلمي.