A FRET Ligation Assay using Fluorescent Proteins for Bacterial Sortase Enzymes

En el mundo microscópico de las bacterias, existe una herramienta molecular especializada conocida como la enzima sortasa. Piense en esta enzima como un par de tijeras moleculares y pegamento combinados. Su trabajo natural es reconocer una secuencia específica de bloques de construcción dentro de una proteína, cortar esa secuencia y luego pegar inmediatamente una nueva pieza en el extremo cortado. Los científicos han aprendido a aprovechar esta capacidad para una técnica llamada ligación mediada por sortasa, un método utilizado para unir diferentes proteínas para crear nuevas medicinas, vacunas y herramientas de diagnóstico. La versión más común de esta enzima proviene de una bacteria llamada Staphylococcus aureus, pero incluso esta herramienta ampliamente utilizada tiene limitaciones. No siempre es eficiente y exige que las piezas de proteínas que une contengan un patrón de aminoácidos muy específico y rígido para poder funcionar. Debido a estas restricciones, los investigadores buscan constantemente mejores versiones de la enzima y nuevas formas de probarlas de manera rápida y precisa.

Para resolver el problema de encontrar mejores enzimas y probar diferentes patrones de proteínas, un equipo de investigadores desarrolló una nueva forma de observar el proceso de ligación en tiempo real. En lugar de adivinar si la enzima pegó con éxito dos piezas de proteína, unieron dos proteínas brillantes diferentes a los extremos de las piezas que querían unir. Una de estas proteínas brillantes es un tono azul verdoso y la otra es un amarillo brillante. Cuando estas dos proteínas están alejadas, brillan de forma independiente. Sin embargo, cuando la enzima sortasa realiza su trabajo con éxito y une las dos piezas de proteína, las proteínas brillantes son forzadas a estar lo suficientemente cerca como para transferir energía entre ellas. Esta transferencia hace que el brillo azul verdoso se desvanezca y el brillo amarillo se intensifique, actuando como un interruptor de luz que señala que la reacción ha ocurrido. Los investigadores utilizaron proteínas brillantes específicas conocidas como mTurquoise2 y SYFP2 para crear esta señal visual.

El estudio se centró en perfeccionar esta prueba de brillo para convertirla en una herramienta fiable de cribado. Los investigadores demostraron que, al cambiar la disposición de las piezas de proteína, podían utilizar este sistema basado en la luz para probar diferentes partes de la reacción. Mostraron que el ensayo podía utilizarse para comprobar qué tan bien la enzima reconoce diferentes patrones iniciales, qué tan bien acepta diferentes segundas piezas para unir, e incluso qué tan efectivas podrían ser las nuevas versiones diseñadas de la propia enzima. El trabajo sugiere que este método proporciona una forma clara y directa de monitorear la formación del producto final sin necesidad de pasos químicos complejos. Si bien el artículo presenta esto como una prueba de concepto, indicando que el método funciona en un entorno de laboratorio, los autores señalan que se necesitará una optimización adicional para que sea adecuado para el cribado de alto rendimiento, donde se podrían probar rápidamente miles de variantes de enzimas diferentes. Este enfoque ofrece un camino prometedor para desarrollar herramientas más eficientes para construir estructuras proteicas complejas para uso médico y científico.