A FRET Ligation Assay using Fluorescent Proteins for Bacterial Sortase Enzymes

बैक्टीरिया की सूक्ष्म दुनिया में, 'सोर्टेज एंजाइम' (sortase enzyme) नामक एक विशेष आणविक उपकरण मौजूद है। इस एंजाइम को आणविक कैंची और गोंद के एक सटीक संयोजन के रूप में सोचें। इसका प्राकृतिक कार्य एक प्रोटीन के भीतर विशिष्ट बिल्डिंग ब्लॉक्स (निर्माण खंडों) के एक अनुक्रम को पहचानना, उस अनुक्रम को काटना और फिर तुरंत उस कटे हुए सिरे पर एक नया टुकड़ा चिपका देना है। वैज्ञानिकों ने इस क्षमता का उपयोग 'सोर्टेज-मीडिएटेड लिगेशन' (sortase-mediated ligation) नामक एक तकनीक के लिए करना सीख लिया है, जो नई दवाएं, टीके और नैदानिक उपकरण बनाने के लिए विभिन्न प्रोटीनों को आपस में जोड़ने के लिए उपयोग की जाने वाली एक विधि है। इस एंजाइम का सबसे सामान्य संस्करण 'स्टैफिलोकोकस ऑरियस' (Staphylococcus aureus) नामक बैक्टीरिया से आता है, लेकिन इस व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरण की भी सीमाएं हैं। यह हमेशा कुशल नहीं होता है, और इसे काम करने के लिए यह आवश्यक होता है कि जिन प्रोटीन टुकड़ों को यह जोड़ता है, उनमें अमीनो एसिड का एक बहुत ही विशिष्ट और कठोर पैटर्न हो। इन बाधाओं के कारण, शोधकर्ता लगातार एंजाइम के बेहतर संस्करणों और उन्हें तेजी से और सटीक रूप से परीक्षण करने के नए तरीकों की खोज में लगे रहते हैं।

इस समस्या को हल करने के लिए कि बेहतर एंजाइम और विभिन्न प्रोटीन पैटर्न को कैसे खोजा जाए, शोधकर्ताओं की एक टीम ने लिगेशन की प्रक्रिया को वास्तविक समय (real time) में देखने का एक नया तरीका विकसित किया है। केवल यह अनुमान लगाने के बजाय कि क्या एंजाइम ने दो प्रोटीन टुकड़ों को सफलतापूर्वक जोड़ दिया है, उन्होंने उन टुकड़ों के सिरों पर दो अलग-अलग चमकने वाले प्रोटीन जोड़े। इनमें से एक चमकने वाला प्रोटीन नीले-हरे रंग का है, और दूसरा चमकीले पीले रंग का है। जब ये दोनों प्रोटीन दूर होते हैं, तो वे स्वतंत्र रूप से चमकते हैं। हालांकि, जब सॉर्टेज एंजाइम अपना काम सफलतापूर्वक करता है और उन दो प्रोटीन टुकड़ों को आपस में जोड़ देता है, तो चमकने वाले प्रोटीनों को एक-दूसरे के इतने करीब लाया जाता है कि वे उनके बीच ऊर्जा स्थानांतरित कर सकें। यह स्थानांतरण नीले-हरे रंग की चमक को फीका कर देता है और पीले रंग की चमक को बढ़ा देता है, जो एक लाइट स्विच की तरह कार्य करता है जो संकेत देता है कि प्रतिक्रिया हुई है। शोधकर्ताओं ने इस दृश्य संकेत को बनाने के लिए mTurquoise2 और SYFP2 नामक विशिष्ट चमकने वाले प्रोटीनों का उपयोग किया।

अध्ययन ने इस चमकने वाले परीक्षण को एक विश्वसनीय उपकरण बनाने पर ध्यान केंद्रित किया। शोधकर्ताओं ने प्रदर्शित किया कि प्रोटीन के टुकड़ों की व्यवस्था बदलकर, वे इस प्रकाश-आधारित प्रणाली का उपयोग प्रतिक्रिया के विभिन्न हिस्सों की जांच करने के लिए कर सकते हैं। उन्होंने दिखाया कि इस परख (assay) का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि एंजाइम विभिन्न शुरुआती पैटर्न को कितनी अच्छी तरह पहचानता है, यह दूसरे टुकड़ों को जोड़ने के लिए कितनी अच्छी तरह स्वीकार करता है, और यहाँ तक कि एंजाइम के नए, इंजीनियर किए गए संस्करण स्वयं कितने प्रभावी हो सकते हैं। यह कार्य सुझाव देता है कि यह विधि जटिल रासायनिक चरणों की आवश्यकता के बिना अंतिम उत्पाद के निर्माण की निगरानी करने का एक स्पष्ट और सीधा तरीका प्रदान करती है। हालांकि यह शोध पत्र इसे एक 'प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट' (proof-of-concept) के रूप में प्रस्तुत करता है, जो यह दर्शाता है कि यह विधि प्रयोगशाला सेटिंग में काम करती है, लेखक बताते हैं कि इसे 'हाई-थ्रूपुट स्क्रीनिंग' (high-throughput screening) के अनुकूल बनाने के लिए, जहाँ हजारों अलग-अलग एंजाइम वेरिएंट का तेजी से परीक्षण किया जा सके, और अधिक अनुकूलन की आवश्यकता होगी। यह दृष्टिकोण चिकित्सा और वैज्ञानिक उपयोग के लिए जटिल प्रोटीन संरचनाओं के निर्माण हेतु अधिक कुशल उपकरण विकसित करने के लिए एक आशाजनक मार्ग प्रदान करता है।