A FRET Ligation Assay using Fluorescent Proteins for Bacterial Sortase Enzymes

Nel mondo microscopico dei batteri, esiste uno strumento molecolare specializzato noto come enzima sortasi. Pensate a questo enzima come a una precisa combinazione di forbici molecolari e colla. Il suo compito naturale è quello di riconoscere una specifica sequenza di blocchi costruttivi all'interno di una proteina, tagliare quella sequenza e poi incollare immediatamente un nuovo pezzo sull'estremità tagliata. Gli scienziati hanno imparato a sfruttare questa capacità per una tecnica chiamata ligazione mediata da sortasi, un metodo utilizzato per cucire insieme diverse proteine al fine di creare nuovi medicinali, vaccini e strumenti diagnostici. La versione più comune di questo enzima proviene da un batterio chiamato Staphylococcus aureus, ma anche questo strumento ampiamente utilizzato presenta dei limiti. Non è sempre efficiente e richiede che i pezzi proteici che unisce contengano un modello di amminoacidi molto specifico e rigido per poter funzionare. A causa di questi vincoli, i ricercatori sono costantemente alla ricerca di versioni migliori dell'enzima e di nuovi modi per testarle rapidamente e con precisione.

Per risolvere il problema di trovare enzimi migliori e testare diversi modelli proteici, un team di ricercatori ha sviluppato un nuovo modo per osservare il processo di ligazione in tempo reale. Invece di indovinare se l'enzima sortasi abbia incollato con successo due pezzi proteici, hanno attaccato due diverse proteine luminose alle estremità dei pezzi che volevano unire. Una di queste proteine luminose è di una tonalità blu-verde, e l'altra è di un giallo brillante. Quando queste due proteine sono lontane, brillano indipendentemente. Tuttavia, quando l'enzima sortasi svolge con successo il suo compito e lega i due pezzi proteici, le proteine luminose vengono costrette a stare abbastanza vicine da trasferire energia tra di loro. Questo trasferimento fa sì che il bagliore blu-verde sbiadisca e che il bagliore giallo si intensifichi, agendo come un interruttore luminoso che segnala che la reazione è avvenuta. I ricercatori hanno utilizzato specifiche proteine luminose note come mTurquoise2 e SYFP2 per creare questo segnale visivo.

Lo studio si è concentrato sul perfezionamento di questo test luminoso per renderlo uno strumento affidabile per lo screening. I ricercatori hanno dimostrato che, cambiando la disposizione dei pezzi proteici, potevano utilizzare questo sistema basato sulla luce per testare diverse parti della reazione. Hanno dimostrato che il saggio poteva essere utilizzato per controllare quanto bene l'enzima riconosca diversi modelli di partenza, quanto bene accetti diversi secondi pezzi da attaccare e persino quanto siano efficaci le nuove versioni ingegnerizzate dell'enzima stesso. Il lavoro suggerisce che questo metodo fornisca un modo chiaro e diretto per monitorare la formazione del prodotto finale senza la necessità di complessi passaggi chimici. Sebbene l'articolo presenti questo come una prova di concetto, indicando che il metodo funziona in un ambiente di laboratorio, gli autori osservano che sarà necessaria un'ulteriore ottimizzazione per renderlo adatto allo screening ad alto rendimento, dove migliaia di diversi varianti enzimatiche potrebbero essere testate rapidamente. Questo approccio offre una strada promettente per lo sviluppo di strumenti più efficienti per costruire strutture proteiche complesse per usi medici e scientifici.