Development of a Highly Sensitive and Rapid Lateral Flow Immunochromatographic Assay for the Quantitative Detection of Small Extracellular Vesicles

داخل كل قطرة من الدم والبول واللعاب، تطفو فقاعات صغيرة تحمل رسائل من الخلايا التي أطلقتها. هذه هي الحويصلات خارج الخلوية، وهي عبارة عن حزم مجهرية مغلفة بغشاء تستخدمه الخلاي للتواصل مع بعضها البعض. ومن بينها، تُعد النسخ الأصغر حجمًا، والمعروفة باسم الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة، مهمة بشكل خاص؛ إذ يُنظر إليها الآن كرسل حيويين يمكنهم الكشف عن الحالة الصحية لخلاياهم الأم، بما في ذلك ما إذا كان هناك ورم ينمو. ولأنها تنتشر بحرية في الجسم، يتوق الأطباء لاستخدامها كوسيلة لتشخيص أمراض مثل السرطان دون الحاجة إلى جراحة غازية. ومع ذلك، فإن العثور على هذه الفقاعات الصغيرة وعدّها أمر صعب للغاية؛ فهي صغيرة، وتختلط في بحر من البروتينات الأخرى، والأدوات المستخدمة حاليًا لدراستها غالبًا ما تكون بطيئة ومكلفة وتتطلب معدات مختبرية معقدة.

لقد طور فريق من الباحثين طريقة جديدة لالتقاط وعدّ هذه الحويصلات تكون أسرع وأرخص وأكثر حساسية من الطرق السابقة. فقد صمموا شريط اختبار متخصص، يشبه اختبار الحمل المنزلي، ولكنه مهندس للكشف عن علامة محددة على سطح هذه الحويصلات. ومن خلال تغيير الترتيب الذي يتم به تطبيق العينة وأدوات الكشف، وباستخدام تفاعل كيميائي باعث للضوء بدلاً من مجرد تغير في اللون، بنوا نظامًا قادرًا على رصد أعداد ضئيلة جدًا من الحويصلات. هذا التقدم يجعل إمكانية إجراء اختبارات دم روتينية وسريعة للكشف المبكر عن الأمراض أقرب إلى الواقع.

ركز الباحثون على بروتين محدد يسمى CD9، والذي يستقر على سطح هذه الحويصلات الصغيرة مثل "العلم". وللعثور عليها، صمموا مقايسة امتصاص مناعي بالتدفق الجانبي، وهي جهاز ينتقل فيه السائل عبر شريط من مادة مسامية. وبينما يتحرك السائل، فإنه يصادف أجسامًا مضادة مصممة للارتباط ببروتين CD9. في الإعداد التقليدي، يتم خلط العينة والأجسام المضادة للكشف معًا في كوب قبل سكبها على الشريط. وقد اختبر الفريق هذا النهج القياسي مقابل طريقة جديدة تتكون من خطوتين؛ ففي الطريقة الجديدة، يتم سكب العينة على الشريط أولاً، مما يسمح للحويصلات بالاستقرار والالتصاق بالشريط من تلقاء نفسها. وفقط بعد استقرارها في مكانها، يتم إضافة الأجسام المضادة للكشف.

حل هذا التغيير في الإجراء مشكلة فيزيائية رئيسية. فعندما تُخلط العينة والأجسام المضادة للكشف مسبقًا، يمكن للأجسام المضادة أن تتزاحم حول الحويصلة وتغطي المواقع التي من المفترض أن تجدها. الأمر يشبه محاولة لصق ملصق على كرة مغطاة بالفعل بملصقات أخرى؛ حيث لن يتمكن الملصق الجديد من إيجاد مكان واضح للالتصاق به. ومن خلال ترك الحويصلات تلتصق بالشريط أولاً، ضمن الباحثون أنها أصبحت مكشوفة وجاهزة. وعندما أُضيفت الأجضاء المضادة للكشف لاحقًا، تمكنت من الارتباط بحرية وقوة. وقد أدى هذا التغيير البسيط في التوقيت إلى إشارة أقوى بكثير، مما أثبت أن ترتيب العمليات يهم بعمق عند التعامل مع أشياء بهذا الصغر.

ولجعل الاختبار أكثر حساسية، استبدل الفريق جزيئات الذهب القياسية التي عادة ما تُنشئ خطًا أحمر مرئيًا بنظام ينتج الضوء. في النسخة القياسية، تتجمع جزيئات الذهب معًا لتشكل خطًا ملونًا يمكن للعين البشرية رؤيته، وبينما يعمل هذا مع الكميات الكبيرة من الهدف، فإنه يعاني عندما تكون الكمية صغيرة جدًا. وبدلاً من ذلك، استخدم الباحثون أجسامًا مضادة مرتبطة بإنزيمات تحفز تفاعلاً كيميائياً، مما يجعل خط الاختبار يتوهج في الظلام. إن الكشف القائم على الضوء أقوى بكثير؛ فقد سمح للجهاز باكتشاف مئة ألف جزيء فقط، وهو مستوى من الحساسية أفضل بمقدار أربعين إلى ستين مرة من الطريقة القائمة على اللون. وهذا الحد حاسم لأن مستواه يطابق التركيزات المنخفضة لعلامات المرض الموجودة في دم مرضى السرطان في مراحله المبكرة.

كما كشفت الدراسة أن أدوات مختلفة هي الأفضل لمهام مختلفة. فبينما يعد النظام القائم على الضوء ممتازًا للعثور على كميات ضئيلة من الهدف، فإن طريقة جزيئات الذهب التقليدية توفر نطاقًا أوسع لقياس الكميات الكبيرة. فقد ظل الاختبار القائم على الذهب دقيقًا وخطيًا حتى عندما كان عدد الجسيمات مرتفعًا جدًا، بينما يمكن للنظام القائم على الضوء أن يصل إلى مرحلة التشبع ويفقد الدقة إذا وُجدت جسيمات كثيرة جدًا. وهذا يعني أن المنصة الجديدة متعددة الاستخدامات: إذ يمكن تهيئتها للبحث عن العلامات النادرة والمبكرة للمرض بحساسية فائقة، أو لقياس المستويات العالية من العلامات لدى المرضى الذين يعانون من حالات متقدمة.

من خلال الجمع بين طريقة أذكى لتحميل العينة وطريقة أكثر حساسية لقراءة النتيجة، ابتكر الباحثون أداة مزدوجة الغرض. إنها بسيطة بما يكفي لاستخدامها خارج المختبرات عالية التقنية، دون الحاجة إلى آلات ضخمة، ومع ذلك فهي حساسة بما يكفي لتلبية متطلبات التشخيص السريري. يوضح هذا العمل أنه من خلال الفهم الدقيق للتفاعلات الفيزيائية بين الجزيئات وآليات شريط الاختبار، يمكن للعلماء التغلب على قيود الطرق القديمة. والنتي نتيجة ذلك هي إطار عملي يمكن أن يجعل المراقبة الروتينية لهذه الرسائل البيولوجية الصغيرة جزءًا قياسيًا من الرعاية الطبية قريبًا.