Development of a Highly Sensitive and Rapid Lateral Flow Immunochromatographic Assay for the Quantitative Detection of Small Extracellular Vesicles

रक्त, मूत्र और लार की प्रत्येक बूंद के भीतर, नन्हे बुलबुले तैरते हैं, जो उन कोशिकाओं से संदेश लेकर चलते हैं जिन्होंने उन्हें छोड़ा है। ये एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स (extracellular vesicles) हैं, जो एक झिल्ली में लिपटे सूक्ष्म पैकेज हैं जिनका उपयोग कोशिकाएं एक-दूसरे से बात करने के लिए करती हैं। इनमें से सबसे छोटे संस्करण, जिन्हें स्मॉल एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स (small extracellular vesicles) के रूप में जाना जाता है, विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। अब उन्हें महत्वपूर्ण संदेशवाहक के रूप में पहचाना जाता है जो अपने मूल कोशिकाओं के स्वास्थ्य को प्रकट कर सकते हैं, जिसमें यह भी शामिल है कि क्या कोई ट्यूमर बढ़ रहा है। चूंकि वे शरीर में स्वतंत्र रूप से घूमते रहते हैं, इसलिए डॉक्टर उन्हें कैंसर जैसी बीमारियों के निदान के लिए एक तरीके के रूप में उपयोग करने के इच्छुक हैं, जिसके लिए आक्रामक सर्जरी की आवश्यकता नहीं होती। हालांकि, इन नन्हे बुलबुलों को ढूंढना और गिनना बेहद कठिन है। वे बहुत छोटे होते हैं, अन्य प्रोटीनों के समुद्र में मिले होते हैं, और वर्तमान में इनका अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण अक्सर धीमे, महंगे और जटिल प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता वाले होते हैं।

शोधकर्ताओं के एक दल ने इन वेसिकल्स को पकड़ने और गिनने का एक नया तरीका विकसित किया है जो पिछले तरीकों की तुलना में अधिक तेज़, सस्ता और कहीं अधिक संवेदनशील है। उन्होंने एक विशेष परीक्षण स्ट्रिप बनाई है, जो घर पर उपयोग होने वाले प्रेगनेंसी टेस्ट की तरह है, लेकिन इसे इन वेसिकल्स की सतह पर मौजूद एक विशिष्ट मार्कर का पता लगाने के लिए इंजीनियर किया गया है। नमूने और पहचान उपकरणों को लागू करने के क्रम को बदलकर, और एक साधारण रंग परिवर्तन के बजाय प्रकाश उत्सर्जक रासायनिक प्रतिक्रिया का उपयोग करके, उन्होंने एक ऐसी प्रणाली बनाई है जो वेसिकल्स की अत्यंत कम संख्या को भी पहचानने में सक्षम है। यह प्रगति प्रारंभिक रोग पहचान के लिए तीव्र, नियमित रक्त परीक्षणों की संभावना को वास्तविकता के बहुत करीब ले आती है।

शोधकर्ताओं ने CD9 नामक एक विशिष्ट प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित किया, जो इन छोटे वेसिकल्स की सतह पर एक झंडे की तरह स्थित होता है। उन्हें खोजने के लिए, उन्होंने एक लेटरल फ्लो इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक असाय (lateral flow immunochromatographic assay) डिजाइन किया, जो एक उपकरण है जहाँ तरल नमूना छिद्रपूर्ण सामग्री की एक पट्टी के साथ चलता है। जैसे-जैसे तरल आगे बढ़ता है, वह उन एंटीबॉडीज के संपर्क में आता है जो CD9 प्रोटीन को पकड़ने के लिए डिज़ाइन की गई हैं। एक पारंपरिक सेटअप में, नमूने और पहचान एंटीबॉडीज को स्ट्रिप पर डालने से पहले एक कप में एक साथ मिलाया जाता है। टीम ने इस मानक दृष्टिकोण का परीक्षण एक नए, दो-चरणीय (two-step) तरीके के विरुद्ध किया। नए तरीके में, स्ट्रिप पर पहले नमूना डाला जाता है, जिससे वेसिकल्स को स्वयं स्ट्रिप पर बैठने और चिपकने का समय मिलता है। केवल तभी जब वे सुरक्षित रूप से अपनी जगह पर हों, पहचान एंटीबॉडीज डाली जाती हैं।

इस प्रक्रिया में बदलाव ने एक प्रमुख भौतिक समस्या को हल किया। जब नमूने और पहचान एंटीबॉडीज को पहले से ही एक साथ मिला दिया जाता है, तो एंटीबॉडीज वेसिकल के चारों ओर भीड़ लगा सकती हैं और उन स्थानों को ढक सकती हैं जिन्हें उन्हें ढूंढना होता है। यह एक गेंद पर लेबल चिपकाने की कोशिश करने जैसा है जो पहले से ही अन्य लेबल से ढकी हुई है; नया लेबल जुड़ने के लिए स्पष्ट स्थान नहीं ढूंढ पाता। वेसिकल्स को पहले स्ट्रिप से जोड़ने देकर, शोधकर्ताओं ने यह सुनिश्चित किया कि वे उजागर और तैयार रहें। जब बाद में पहचान एंटीबॉडीज डाली गईं, तो वे स्वतंत्र रूप से और मजबूती से जुड़ सकीं। इस समय के बदलाव ने एक संकेत दिया जो काफी अधिक शक्तिशाली था, जिससे यह सिद्ध हुआ कि इन अत्यंत छोटी वस्तुओं के साथ संचालन का क्रम बहुत मायने रखता है।

परीक्षण को और भी अधिक संवेदनशील बनाने के लिए, टीम ने उन मानक गोल्ड पार्टिकल्स (gold particles) को बदल दिया जो आमतौर पर एक दृश्य लाल रेखा बनाते हैं, और एक ऐसी प्रणाली का उपयोग किया जो प्रकाश उत्पन्न करती है। मानक संस्करण में, गोल्ड पार्टिकल्स एक साथ क्लस्टर बनाते हैं जिससे मानव आंख देख सकने वाली रंगीन रेखा बनती है। हालांकि यह लक्ष्य की बड़ी मात्रा के लिए काम करता है, लेकिन बहुत कम मात्रा होने पर यह संघर्ष करता है। शोधकर्ताओं ने इसके बजाय एंजाइमों से जुड़ी एंटीबॉडीज का उपयोग किया जो एक रासायनिक प्रतिक्रिया को सक्रिय करती हैं, जिससे परीक्षण रेखा अंधेरे में चमक उठती है। यह प्रकाश-आधारित पहचान कहीं अधिक शक्तिशाली है। इसने डिवाइस को एक लाख कणों तक का पता लगाने में सक्षम बनाया, जो कि रंग-आधारित पद्धति की तुलना में चालीस से साठ गुना बेहतर संवेदनशीलता का स्तर है। यह सीमा महत्वपूर्ण है क्योंकि यह शुरुआती चरण के कैंसर वाले रोगियों के रक्त में पाए जाने वाले रोग के मार्करों की कम सांद्रता से मेल खाती है।

अध्ययन ने यह भी खुलासा किया कि विभिन्न कार्यों के लिए अलग-अलग उपकरण सबसे अच्छे होते हैं। जबकि प्रकाश-आधारित प्रणाली किसी लक्ष्य की सूक्ष्म मात्रा को खोजने के लिए उत्कृष्ट है, पारंपरिक गोल्ड पार्टिकल विधि बड़ी मात्रा को मापने के लिए एक विस्तृत रेंज प्रदान करती है। गोल्ड-आधारित परीक्षण बहुत अधिक कणों की संख्या होने पर भी सटीक और रैखिक (linear) बना रहा, जबकि प्रकाश-आधारित प्रणाली बहुत अधिक कणों की उपस्थिति में संतृप्त (saturated) हो सकती है और अपनी सटीकता खो सकती है। इसका अर्थ यह है कि नया प्लेटफॉर्म बहुमुखी है: इसे बीमारी के दुर्लभ, शुरुआती संकेतों को अत्यधिक संवेदनशीलता के साथ खोजने के लिए, या उन्नत स्थितियों वाले रोगियों में मार्करों के उच्च स्तर को मापने के लिए कॉन्फ़िगर किया जा सकता है।

नमूने को लोड करने के स्मार्ट तरीके और परिणाम पढ़ने के अधिक संवेदनशील तरीके को जोड़कर, शोधकर्ताओं ने एक दोहरे उद्देश्य वाला उपकरण बनाया है। यह इतना सरल है कि इसे बिना किसी हाई-टेक लैब के, भारी मशीनरी के बिना भी उपयोग किया जा सकता है, फिर भी नैदानिक निदान (clinical diagnostics) की मांगों को पूरा करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है। यह कार्य प्रदर्शित करता है कि अणुओं के बीच भौतिक अंतःक्रियाओं और टेस्ट स्ट्रिप की यांत्रिकी को सावधानीपूर्वक समझकर, वैज्ञानिक पुराने तरीकों की सीमाओं को पार कर सकते हैं। परिणाम एक व्यावहारिक ढांचा है जो जल्द ही इन नन्हे जैविक संदेशवाहकों की नियमित निगरानी को चिकित्सा देखभाल का एक मानक हिस्सा बना सकता है।