Development of a Highly Sensitive and Rapid Lateral Flow Immunochromatographic Assay for the Quantitative Detection of Small Extracellular Vesicles

In elke druppel bloed, urine en speeksel drijven minuscule belletjes die boodschappen overbrengen van de cellen die ze hebben vrijgegeven. Dit zijn extracellulaire blaasjes, microscopische pakketjes gehuld in een membraan die cellen gebruiken om met elkaar te communicen. Onder deze groep zijn de kleinste versies, bekend als kleine extracellulaire blaasjes, bijzonder belangrijk. Ze worden nu erkend als vitale boodschappers die de gezondheid van hun moedercellen kunnen onthullen, inclusief of er een tumor groeit. Omdat ze vrij door het lichaam circuleren, zijn artsen enthousiast om ze te gebruiken als een manier om ziekten zoals kanker te diagnosticeren zonder dat daarvoor invasieve chirurgie nodig is. Het vinden en tellen van deze piepkleine belletjes is echter berucht moeilijk. Ze zijn klein, ze zitten gemengd in een zee van andere eiwitten, en de instrumenten die momenteel worden gebruikt om ze te bestuderen, zijn vaak traag, duur en vereisen complexe laboratoriumapparatuur.

Een team van onderzoekers heeft een nieuwe manier ontwikkeld om deze blaasjes te vangen en te tellen die sneller, goedkoper en veel gevoeliger is dan voorheen gebruikte methoden. Ze hebben een gespecialiseerde teststrip ontwikkeld, vergelijkbaar met een zwangerschapstest voor thuis, maar dan ontworpen om een specifieke marker op het oppervlak van deze blaasjes te detecteren. Door de volgorde waarin het monster en de detectietools worden toegepast te veranderen, en door een lichtgevende chemische reactie te gebruiken in plaats van een eenvoudige kleurverandering, hebben ze een systeem gebouwd dat in staat is om extreem lage aantallen blaasjes op te sporen. Deze vooruitgang brengt de mogelijkheid van snelle, routinematige bloedtests voor vroege detectie van ziekten veel dichter bij de realiteit.

De onderzoekers richtten zich op een specifiek eiwit genaamd CD9, dat op het oppervlak van deze kleine blaasjes zit als een vlag. Om ze te vinden, ontwierpen ze een laterale flow immunochromatografische assay, een apparaat waarbij een vloeibaar monster langs een strip van poreus materiaal reist. Terwijl de vloeistof beweegt, komt deze antilichamen tegen die ontworpen zijn om het CD9-eiwit vast te grijpen. In een traditionele opstelling worden het monster en de detectie-antilichamen samen gemengd in een bekertje voordat ze op de strip worden gegoten. Het team testte deze standaardmethode tegen een nieuwe, tweestapsmethode. In de nieuwe methode wordt het monster eerst op de strip gegoten, zodat de blaasjes de kans krijgen om op hun eigen wijze op de strip te gaan zitten en zich eraan te hechten. Pas nadat ze stevig op hun plaats zitten, worden de detectie-antilichamen toegevoegd.

Deze wijziging in de procedure loste een groot fysiek probleem op. Wanneer het monster en de detectie-antilichamen vooraf worden gemengd, kunnen de antilichamen rond het blaasje gaan klonteren en de exacte plekken afdekken die ze juist moeten vinden. Dit is als proberen een label op een bal te plakken die al bedekt is met andere labels; het nieuwe label kan geen vrije plek vinden om zich aan te bevestigen. Door de blaasjes eerst aan de strip te laten hechten, zorgden de onderzoekers ervoor dat ze blootgesteld en klaar waren. Toen de detectie-antilichamen later werden toegevoegd, konden ze vrij en sterk binden. Deze eenvoudige verschuiving in timing resulteerde in een signaal dat aanzienlijk sterker was, wat bewees dat de volgorde van handelingen diepgaand uitmaakt bij het werken met objecten die zo klein zijn.

Om de test nog gevoeliger te maken, verving het team de standaard gouddeeltjes die normaal gesproken een zichtbare rode lijn creëren door een systeem dat licht produceert. In de standaardversie klonteren gouddeeltjes samen om een gekleurde lijn te vormen die het menselijk oog kan zien. Hoewel dit werkt voor grotere hoeveelheden van het doelwit, heeft het moeite wanneer de hoeveelheid zeer klein is. De onderzoekers gebruikten in plaats daarvan antilichamen die gekoppeld zijn aan enzymen die een chemische reactie triggeren, waardoor de testlijn in het donker gaat gloeien. Deze lichtgebaseerde detectie is veel krachtiger. Het stelde het apparaat in staat om zelfs slechts honderdduizend deeltjes te detecteren, een gevoeligheidsniveau dat veertig tot zestig keer beter is dan de op kleur gebaseerde methode. Deze drempelwaarde is cruciaal omdat deze overeenkomt met de lage concentraties ziektemarkers die worden gevonden in het bloed van patiënten met kanker in een vroeg stadium.

De studie onthulde ook dat verschillende instrumenten het beste zijn voor verschillende taken. Terwijl het lichtgebaseerde systeem uitstekend is voor het vinden van minieme hoeveelheden van een doelwit, biedt de traditionele methode met gouddeeltjes een breder bereik voor het meten van grote hoeveelheden. De op goud gebaseerde test bleef accuraat en lineair, zelfs wanneer het aantal deeltjes zeer hoog was, terwijl het lichtgebaseerde systeem verzadigd kon raken en aan nauwkeurigheid kon verliezen als er te veel deeltjes aanwezig waren. Dit betekent dat het nieuwe platform veelzijdig is: het kan worden geconfigureerd om zeldzame, vroege tekenen van ziekte met extreme gevoeligheid op te sporen, of om hoge niveaus van markers bij patiënten met gevorderde aandoeningen te meten.

Door een slimmere manier van laden te combineren met een gevoeligere manier van resultaten aflezen, hebben de onderzoekers een tweeledig hulpmiddel gecreëerd. Het is eenvoudig genoeg om buiten een hoogtechnologische laboratoriumomgeving te gebruiken, zonder dat er zware machines nodig zijn, en toch gevoelig genoeg om te voldoen aan de eisen van klinische diagnostiek. Dit werk laat zien dat wetenschappers, door zorgvuldig begrip van de fysieke interacties tussen moleculen en de mechanica van de teststrip, de beperkingen van oudere methoden kunnen overwinnen. Het resultaat is een praktisch kader dat de routinematige monitoring van deze kleine biologische boodschappers binnenkort een standaard onderdeel van de medische zorg zou kunnen maken.