Development of a Highly Sensitive and Rapid Lateral Flow Immunochromatographic Assay for the Quantitative Detection of Small Extracellular Vesicles

In ogni goccia di sangue, urina e saliva, galleggiano minuscole bolle che trasportano messaggi dalle cellule che le hanno rilasciate. Queste sono le vescicole extracellulari, pacchetti microscopici avvolti in una membrana che le cellule usano per comunicare tra loro. Tra queste, le versioni più piccole, note come piccole vescicole extracellulari, sono particolarmente importanti. Esse sono ora riconosciute come messaggeri vitali che possono rivelare lo stato di salute delle loro cellule madri, compreso il fatto che un tumore stia crescendo. Poiché circolano liberamente nel corpo, i medici sono ansiosi di usarle come un modo per diagnosticare malattie come il cancro senza necessità di interventi chirurgici invasivi. Tuttavia, trovare e contare queste minuscole bolle è notoriamente difficile. Sono piccole, sono mescolate in un mare di altre proteine e gli strumenti attualmente utilizzati per studiarle sono spesso lenti, costosi e richiedono attrezzature di laboratorio complesse.

Un team di ricercatori ha sviluppato un nuovo modo per catturare e contare queste vescicole che è più veloce, economico e molto più sensibile rispetto ai metodi precedenti. Hanno creato una striscia reattiva specializzata, simile a un test di gravidanza domestico, ma progettata per rilevare un marcatore specifico sulla superficie di queste vescicole. Cambiando l'ordine in cui il campione e gli strumenti di rilevamento vengono applicati, e utilizzando una reazione chimica che emette luce invece di un semplice cambiamento di colore, hanno costruito un sistema capace di individuare un numero estremamente basso di vescicole. Questo progresso porta la possibilità di test del sangue rapidi e di routine per la diagnosi precoce delle malattie molto più vicina alla realtà.

I ricercatori si sono concentrati su una proteina specifica chiamata CD9, che si trova sulla superficie di queste piccole vescicole come una bandiera. Per trovarle, hanno progettato un saggio immunocromatografico a flusso laterale, un dispositivo in cui un campione liquido viaggia lungo una striscia di materiale poroso. Mentre il liquido si muove, incontra anticorpi progettati per afferrare la proteina CD9. In una configurazione tradizionale, il campione e gli anticorpi di rilevamento vengono mescolati insieme in una coppetta prima di essere versati sulla striscia. Il team ha testato questo approccio standard rispetto a un nuovo metodo in due fasi. Nel nuovo metodo, il campione viene versato sulla striscia per primo, permettendo alle vescicole di depositarsi e attaccarsi alla striscia da sole. Solo dopo che sono ben salde al loro posto, vengono aggiunti gli anticorpi di rilevamento.

Questo cambiamento di procedura ha risolto un importante problema fisico. Quando il campione e gli anticorpi di rilevamento vengono mescolati in precedenza, gli anticorpi possono affollarsi attorno alla vescicola e coprire proprio i punti che dovrebbero trovare. È come cercare di attaccare un'etichetta su una pallina che è già coperta da altre etichette; la nuova etichetta non può trovare un punto libero a cui attaccarsi. Lasciando che le vescicole si attacchino alla striscia per prime, i ricercatori hanno garantito che fossero esposte e pronte. Quando gli anticorpi di rilevamento venivano aggiunti successivamente, potevano legarsi liberamente e con forza. Questo semplice spostamento temporale ha prodotto un segnale significativamente più forte, dimostrando che l'ordine delle operazioni conta profondamente quando si tratta di oggetti così piccoli.

Per rendere il test ancora più sensibile, il team ha sostituito le classiche particelle d'oro che di solito creano una linea rossa visibile con un sistema che produce luce. Nella versione standard, le particelle d'oro si raggruppano per formare una linea colorata che l'occhio umano può vedere. Sebbene questo funzioni per quantità maggiori del bersaglio, fatica quando la quantità è molto piccola. I ricercatori hanno invece utilizzato anticorpi legati a enzimi che innescano una reazione chimica, facendo sì che la linea del test brilli al buio. Questo rilevamento basato sulla luce è molto più potente. Ha permesso al dispositivo di rilevare anche solo centomila particelle, un livello di sensibilità che è quaranta o sessanta volte superiore al metodo basato sul colore. Questa soglia è critica perché corrisponde alle basse concentrazioni di marcatori di malattie presenti nel sangue dei pazienti con cancro in fase precoce.

Lo studio ha anche rivelato che strumenti diversi sono migliori per lavori diversi. Mentre il sistema basato sulla luce è eccellente per trovare tracce minime di un bersaglio, il tradizionale metodo con particelle d'oro offre un intervallo più ampio per misurare grandi quantità. Il test basato sull'oro è rimasto accurato e lineare anche quando il numero di particelle era molto elevato, mentre il sistema basato sulla luce poteva saturarsi e perdere accuratezza se erano presenti troppe particelle. Ciò significa che la nuova piattaforma è versatile: può essere configurata per dare la caccia a segni rari e precoci di malattia con estrema sensibilità, oppure per misurare alti livelli di marcatori in pazienti con condizioni avanzate.

Combinando un modo più intelligente di caricare il campione con un modo più sensibile di leggere il risultato, i ricercatori hanno creato uno strumento a duplice scopo. È abbastanza semplice da poter essere utilizzato al di fuori di un laboratorio ad alta tecnologia, non richiedendo macchinari ingombranti, ma è abbastanza sensibile da soddisfare le esigenze della diagnostica clinica. Questo lavoro dimostra che, comprendendo attentamente le interazioni fisiche tra le molecole e la meccanica della striscia reattiva, gli scienziati possono superare i limiti dei metodi più vecchi. Il risultato è un quadro pratico che potrebbe presto rendere il monitoraggio di routine di questi minuscoli messaggeri biologici una parte standard della cura medica.