Development of a Highly Sensitive and Rapid Lateral Flow Immunochromatographic Assay for the Quantitative Detection of Small Extracellular Vesicles

In jedem Tropfen Blut, Urin und Speichel schweben winzige Bläschen, die Botschaften von den Zellen tragen, die sie freigesetzt haben. Dies sind extrazelluläre Vesikel, mikroskopisch kleine Pakete, die von einer Membran umschlossen sind und die Zellen nutzen, um miteinander zu kommunizieren. Unter ihnen sind die kleinsten Versionen, bekannt als kleine extrazelluläre Vesikel, besonders wichtig. Sie werden heute als lebenswichtige Botenstoffe anerkannt, die den Gesundheitszustand ihrer Ursprungszellen offenbaren können, einschließlich der Frage, ob ein Tumor wächst. Da sie frei im Körper zirkulieren, sind Ärzte bestrebt, sie als Weg zur Diagnose von Krankheiten wie Krebs zu nutzen, ohne dass dafür invasive Operationen erforderlich sind. Es ist jedoch äußerst schwierig, diese winzigen Bläschen aufzufinden und zu zählen. Sie sind klein, sie sind inmitten eines Meeres aus anderen Proteinen vermischt, und die Werkzeuge, die derzeit zur Untersuchung von ihnen verwendet werden, sind oft langsam, teuer und erfordern komplexe Laborausrüstung.

Ein Forschungsteam hat eine neue Methode entwickelt, um diese Vesikel einzufangen und zu zählen, die schneller, günstiger und weitaus empfindlicher ist als bisherige Methoden. Sie haben einen speziellen Teststreifen entwickelt, der einem Schwangerschaftstest für zu Hause ähnelt, aber darauf ausgelegt ist, einen spezifischen Marker auf der Oberfläche dieser Vesikel zu erkennen. Durch die Änderung der Reihenfolge, in der die Probe und die Detektionswerkzeuge aufgetragen werden, und durch die Verwendung einer lichtemittierenden chemischen Reaktion anstelle einer einfachen Farbänderung, haben sie ein System gebaut, das in der Lage ist, extrem geringe Zahlen von Vesikeln zu entdecken. Dieser Fortschritt bringt die Möglichkeit schneller, routinemäßiger Bluttests zur Früherkennung von Krankheiten in die unmittelbare Nähe der Realität.

Die Forscher konzentrierten sich auf ein spezifisches Protein namens CD9, das wie eine Flagge auf der Oberfläche dieser kleinen Vesikel sitzt. Um sie zu finden, entwarfen sie einen lateralen Fluss-Immunchromatographie-Assay, ein Gerät, bei dem eine Flüssigkeitsprobe entlang eines Teststreifens aus porösem Material wandert. Während die Flüssigkeit wandert, trifft sie auf Antikörper, die darauf ausgelegt sind, das CD9-Protein zu greifen. In einem traditionellen Aufbau werden die Probe und die Detektionsantikörper in einem Becher gemischt, bevor sie auf den Streifen gegossen werden. Das Team testete diesen Standardansatz gegen eine neue, zweistufige Methode. In der neuen Methode wird die Probe zuerst auf den Streifen gegeben, sodass sich die Vesikel selbstständig auf dem Streifen absetzen und anheften können. Erst nachdem sie sicher an ihrem Platz sind, werden die Detektionsantikörper hinzugefügt.

Diese Änderung des Verfahrens löste ein großes physikalisches Problem. Wenn die Probe und die Detektionsantikörper vorab gemischt werden, können die Antikörper das Vesikel umstellen und genau die Stellen verdecken, die sie eigentlich finden sollen. Dies ist so, als würde man versuchen, ein Etikett auf einen Ball zu kleben, der bereits mit anderen Etiketten bedeckt ist; das neue Etikett kann keinen freien Platz finden, um sich anzuheften. Indem sie die Vesikel zuerst am Streifen anheften ließen, stellten die Forscher sicher, dass diese exponiert und bereit waren. Als die Detektionsantikörper später hinzugefügt wurden, konnten sie frei und stark binden. Diese einfache Verschiebung des Zeitpunkts führte zu einem signifikant stärkeren Signal und bewies, dass die Reihenfolge der Abläufe bei Objekten dieser geringen Größe eine tiefgreifende Bedeutung hat.

Um den Test noch empfindlicher zu machen, ersetzte das Team die Standard-Goldpartikel, die normalerweise eine sichtbare rote Linie erzeugen, durch ein System, das Licht erzeugt. In der Standardversion verklumpen Goldpartikel zusammen, um eine farbige Linie zu bilden, die das menschliche Auge sehen kann. Während dies bei größeren Mengen des Zielobjekts funktioniert, stößt es bei sehr geringen Mengen an Grenzen. Die Forscher verwendeten statstattdessen Antikörper, die mit Enzymen verknüpft sind, welche eine chemische Reaktion auslösen und dazu führen, dass die Testlinie im Dunkeln leuchtet. Diese lichtbasierte Detektion ist weitaus leistungsfähiger. Sie ermöglichte es dem Gerät, so wenig wie einhunderttausend Partikel zu detektieren – ein Empfindlichkeitsniveau, das vierzig- bis sechzigmal besser ist als die farbbasierte Methode. Diese Schwelle ist entscheidend, da sie mit den niedrigen Konzentrationen von Krankheitsmarkern im Blut von Patienten im Frühstadium von Krebs übereinstimmt.

Die Studie zeigte auch, dass unterschiedliche Werkzeuge für unterschiedliche Aufgaben am besten geeignet sind. Während das lichtbasierte System exzellent darin ist, Spuren eines Zielobjekts zu finden, bietet die traditionelle Methode mit Goldpartikeln einen breiteren Bereich für die Messung großer Mengen. Der Gold-basierte Test blieb auch bei einer sehr hohen Anzahl von Partikeln genau und linear, wohingegen das lichtbasierte System gesättigt werden und an Genauigkeit verlieren konnte, wenn zu viele Partikel vorhanden waren. Dies bedeutet, dass die neue Plattform vielseitig ist: Sie kann so konfiguriert werden, dass sie entweder mit extremer Sensibilität nach seltenen, frühen Anzeichen einer Krankheit jagt oder hohe Mengen an Markern bei Patienten mit fortgeschrittenen Zuständen misst.

Durch die Kombination einer intelligenteren Art der Probenbeladung mit einer empfindlicheren Art der Ergebnismessung haben die Forscher ein zweckgebundenes Werkzeug geschaffen. Es ist einfach genug, um außerhalb eines High-Tech-Labors verwendet zu werden, da es keine sperrigen Maschinen erfordert, und dennoch empfindlich genug, um den Anforderungen der klinischen Diagnostik gerecht zu werden. Diese Arbeit zeigt, dass Wissenschaftler durch ein tiefes Verständnis der physikalischen Interaktionen zwischen Molekülen und der Mechanik des Teststreifens die Einschränkungen älterer Methoden überwinden können. Das Ergebnis ist ein praktischer Rahmen, der die routinemäßige Überwachung dieser winzigen biologischen Botenstoffe schon bald zu einem Standardbestandteil der medizinischen Versorgung machen könnte.