CRISPR RNA-independent activation of Cas12a

داخل خلايا كل كائن حي تقريباً، من البكتيريا إلى البشر، هناك حرب صامتة ومستمرة ضد الفيروسات الغازية. وللبقاء على قيد الحياة، طورت البكتيريا نظاماً مناعياً متطوراً يعمل مثل حارس أمن جزيئي. هذا النظام، المعروف باسم "كريسبر" (CRISPR)، يسمح للخلية بتذكر الإصابات السابقة والتعرف على شفرات جينية محددة تنتمي للعدو. عندما يهاجم فيروس ما، تقوم الخلية بنشر بروتين يسمى "Cas12a". وبناءً على الطريقة التي فهم بها العلماء هذه العملية لسنوات، فإن البروتين يشبه جندياً كفيفاً يحتاج إلى شيئين للعمل: خريطة محددة، تسمى "الرنا الموجه" (guide RNA)، لتخبره أين يبحث، ومعلماً محدداً على الحمض النووي للعدو، يسمى "تسلسل PAM"، للتأكد من أنه وجد الهدف الصحيح. وفقط عندما يتوفر كل من الخريطة والمعلم، يستيقظ البروتين ويبدأ بالقطع، مدمرًا المادة الوراثية للغازي. وقد كان هذا الشرط الصارم بوجود كل من الدليل والمعلم هو الأساس لاستخدام هذه البروتينات في المختبرات لتعديل الجينات أو اكتشاف الأمراض.

لعقود من الزمن، اعتقد الباحثون أن هذا التحقق المكون من خطوتين هو الطريقة الوحيدة لتنشيط البروتين. وافترضوا أنه بدون الرنا الموجه المحدد والمعلم الصحيح، سيبقى البروتين خاملاً وغير ضار وغير قادر على قطع أي شيء. وقد شكل هذا الاعتقاد كيفية تصميم العلماء لأدوات العثور على الفيروسات أو الطفرات، مع الحرص دائماً على تضمين كل من الدليل والمعلم في اختباراتهم. ومع ذلك، فإن دراسة جديدة أجراها فريق من البراحثين من جامعة تورنتو، وجامعة تكساس في أوستن، ومؤسسات أخرى، تتحدى هذا المنظور الذي ساد لفترة طويلة. فقد اكتشفوا أن بروتين "Cas12a" أكثر مرونة مما أدركه الجميع؛ فهو لا يحتاج بدقة إلى الرنا الموجه التقليدي أو المعلم المحدد ليبدأ العمل. بدلاً من ذلك، يمكن تنشيط البروتين بواسطة قطعة أبسط وأقصر من "الرنا" (RNA) تنزلق مباشرة في جيب الارتباط الخاص بالبروتين، متجاوزة القواعد المعتادة تماماً.

بدأ الباحثون تحقيقهم أثناء العمل على أداة تشخيصية مختلفة. كانوا يختبرون كيفية تفاعل بروتين "Cas12a" مع سلاسل رنا قصيرة متنوعة. ولدهشتهم، وجدوا أن البروتين يبدأ بالقطع حتى بعد إزالة الرنا الموجه التقليدي تماماً. وفي الواقع، عمل البروتين بنفس الكفاءة، أو أحياناً بشكل أفضل، بدون الدليل. وقد حددوا أن هذه السلاسل القصيرة من الرنا، التي أطلقوا عليها اسم "miniCaRs"، كانت كافية لإيقاظ البروتين. هذه الـ "miniCaRs" صغيرة جداً، حيث يبلغ طولها حوالي اثنين وعشرين حرفاً فقط، وتتناسب مباشرة في المساحة التي يحمل فيها البروتين عادةً دليله الموجه. وبمجرد استقرار الـ "miniCaR" في مكانها، يغير البروتين شكله قليلاً، فاتحاً آلية القطع الخاصة به. ويحدث هذا حتى لو كان الحمض النووي المستهدف يفتقر إلى تسلسل المعلم الذي كان يُعتقد سابقاً أنه إلزامي.

ولفهم كيفية حدوث ذلك بالضبط، استخدم الفريق تقنية تصوير قوية تسمى "المجهر الإلكتروني برد المبرد" (cryo-electron microscopy). سمحت لهم هذه الطريقة بالتقاط لقطات عالية الدقة للبروتين أثناء عمله. وكشفت الصور أن الهيكل العام للبروتين ظل قوياً ومستقراً، لكن الأجزاء التي ترتبط عادةً بتسلسل المعلم كانت مرتخية وغير منظمة. لقد تخلى البروتين عن شرط المعلم؛ وبدلاً من ذلك، تمسك بهيكل هجين غريب مكون من الرنا القصير وقطعة من الحمض النووي (DNA)، مرتبة في اتجاه يبدو مختلفاً عن النموذج القياسي. وكان "الغطاء" الذي يغطي موقع القطع عادةً أكثر مرونة، حيث ظل مفتوحاً للسماح للبروتين بقطع خيوط الحمض النووي الأخرى القريبة. أكدت هذه الأدلة البصرية أن البروتين قد وجد طريقة جديدة للتفعيل، لا تتبع التعليمات القديمة.

ثم اختبر الفريق مدى دقة طريقة التنشيط الجديدة هذه. ووجدوا أن البروتين لا يزال بإمكناه التمييز بين التسلسلات الجينية المتشابهة جداً. فإذا لم يتطابق الرنا القصير والحمض النووي المستهدف تماماً في المنتصف، فلن يقوم البروتين بالقطع. ومع ذلك، إذا كان عدم التطابق في النهايات القصوى للتسلسل، كان البروتين أكثر تسامحاً. يشير هذا إلى أن البروتين لا يزال حذراً جداً فيما يخص ما يهاجمه، حتى بدون دليله المعتاد. كما اكتشفوا أن نوع الحمض النووي الذي يقطعه البروت प्रोटीन يختلف في هذا الوضع الجديد؛ فبينما يفضل النظام القياسي أنواعاً معينة من تقارير الحمض النووي، فإن هذه الطريقة الجديدة تعمل بشكل أفضل مع تسلسلات الحمض النووي الغنية ببنية بناء محددة تسمى "السيتوزين". ويشير هذا التحول في التفضيل إلى أن البيئة الداخلية للبروتين قد تغيرت، مما غير كيفية تفاعله مع أهدافه.

إن تداعيات هذا الاكتشاف كبيرة فيما يتعلق بكيفية اكتشاف الأمراض. نظرًا لأن النظام لم يعد بحاجة إلى الرنا الموجه المعقد أو المعلم المحدد، يمكن استخدامه بشكل أبسط بكثير. وقد بنى الباحثون منصة تشخيصية جديدة تسمى "COMPANION"، تستخدم هذا التنشيط المستقل عن "crRNA" للعثور على كميات ضئيلة من المادة الوراثية للفيروسات. وقد أظهروا أن هذا النظام يمكنه اكتشاف الفيروسات التنفسية، مثل الإنفلونزا والفيروس المخلوي التنفسي، مباشرة من عينات المرضى دون الحاجة إلى تضخيم المادة الوراثية أولاً. وفي الاختبارات التي أجريت على عينات مرضى حقيقيين، طابقت المنصة دقة الاختبارات المختبرية القياسية، حيث حددت الحالات الإيجابية والسلبية بدقة عالية. كما أنها عملت بشكل جيد في السوائل المعقدة مثل اللعاب، مما يشير إلى إمكانية استخدامها للاختبار السريع في العيادات أو في المنزل.

يعيد هذا العمل تعريف فهمنا لكيفية عمل هذه الآلات الجزيئية. فهو يظهر أن بروتين "Cas12a" ليس أداة جامدة تعمل فقط تحت مجموعة واحدة من الظروف، بل هو نظام ديناميكي قادر على التكيف مع المدخلات المختلفة. إن قدرة البروتين على التنشيط بواسطة جزيء رنا بسيط، دون الحاجة إلى دليل أو معلم، تفتح آفاقاً جديدة لتصميم أدوات أبسط وأكثر قوة في مجالات العلوم والطب. لقد أثبت الباحثون أن القواعد التي تحكم هذا النظام المناعي أكثر مرونة مما كان يُعتقد سابقاً، مما يكشف عن مسار خفي يمكن للبروتين استخدامه لحماية الخلية، أو في أيدي العلماء، لاكتشاف الأمراض بسرعة وحساسية فائقتين.