CRISPR RNA-independent activation of Cas12a

In de cellen van bijna elk levend organisme, van bacteriën tot mensen, woedt een constante, stille oorlog tegen binnenvallende virussen. Om te overleven, hebben bacteriën een geavanceerd immuunsysteem ontwikkeld dat werkt als een moleculaire beveiliger. Dit systeem, bekend als CRISPR, stelt de cel in staat om eerdere infecties te onthouden en specifieke genetische codes van de vijand te herkennen. Wanneer een virus aanvalt, zet de cel een eiwit in genaamd Cas12a. Op de manier waarop wetenschappers dit proces jarenlang hebben begrepen, is het eiwit als een blinde soldaat die twee dingen nodig heeft om te kunnen handelen: een specifieke kaart, een zogenaamde gids-RNA, om het te vertellen waar het moet zoeken, en een specifiek herkenningspunt op het DNA van de vijand, een PAM-sequentie genoemd, om te bevestigen dat het het juiste doelwit heeft gevonden. Pas wanneer zowel de kaart als het herkenningspunt aanwezig zijn, wordt het eiwit wakker en begint het te snijden, waardoor het genetisch materiaal van de indringer wordt vernietigd. Deze strikte vereiste voor zowel een gids als een herkenningspunt vormde de basis voor het gebruik van deze eiwitten in laboratoria om genen te bewerken of ziekten te detecteren.

Decennialang geloofden onderzoekers dat deze tweestapscontrole de enige manier was waarop het eiwit geactiveerd kon worden. Ze namen aan dat het eiwit zonder de specifieke gids-RNA en het juiste herkenningspunt inactief, ongevaarlijk en niet in staat zou blijven om iets te snijden. Dit geloof vormde de manier waarop wetenschappers instrumenten ontwierpen om virussen of mutaties te vinden, waarbij ze er altijd voor zorgden dat ze zowel de gids als het herkenningspunt in hun tests opnamen. Een nieuwe studie door een team van onderzoekers van de Universiteit van Toronto, de Universiteit van Texas at Austin en andere instellingen daagt dit lang gehouden beeld echter uit. Ze ontdekten dat het Cas12a-eiwit veel flexibeler is dan iedereen besefte. Het heeft de traditionele gids-RNA of het specifieke herkenningspunt niet strikt nodig om aan het werk te gaan. In plaats daarvan kan het eiwit worden geactiveerd door een veel eenvoudiger, korter stukje RNA dat direct in de bindingspocket van het eiwit glipt, waardoor de gebruikelijke regels volledig worden omzeild.

De onderzoekers begonnen hun onderzoek terwijl ze werkten aan een andere diagnostische tool. Ze testten hoe het Cas12a-eiwit reageerde op diverse korte RNA-sequenties. Tot hun verbazing ontdekten ze dat het eiwit begon te snijden, zelfs toen ze de traditionele gids-RNA volledig verwijderden. Sterker nog, het eiwit werkte net zo goed, of soms zelfs beter, zonder de gids. Ze identificeerden dat deze korte RNA-sequenties, die ze "miniCaRs" noemden, voldoende waren om het eiwit wakker te maken. Deze miniCaRs zijn piepklein, slechts ongeveer tweeëntwintig letters lang, en ze passen direct in de ruimte waar het eiwit gewoonlijk zijn gids-RNA vasthoudt. Zodra de miniCaR op zijn plaats is, verandert het eiwit licht van vorm, waardoor het snijmechanisme opent. Dit gebeurt zelfs als het doel-DNA het specifieke herkenningspunt mist dat voorheen als verplicht werd beschouwd.

Om precies te begrijpen hoe dit gebeurde, gebruikte het team een krachtige beeldvormingstechniek genaamd cryo-elektronenmicroscopie. Deze methode stelde hen in staat om hoogresolutie-opnames van het eiwit in actie te maken. De beelden onthulden dat de algemene structuur van het eiwit sterk en stabiel bleef, maar dat de delen die normaal gesproken op het herkenningspunt vergrendelen, los en ongeorganiseerd waren. Het eiwit had de vereiste voor het herkenningspunt losgelaten. In plaats daarvan hield het zich vast aan een vreemde hybride structuur gevormd door het korte RNA en een stukje DNA, gerangschikt in een oriëntatie die anders leek dan het standaardmodel. De "deksel" die normaal gesproken de snijplaats afdekt, was flexibeler en bleef openstaan om het eiwit toe te staan nabijgelegen DNA-strengen door te snijden. Dit visuele bewijs bevestigde dat het eiwit een nieuwe manier had gevonden om aan te gaan, een manier die de oude instructies niet volgde.

Het team testte vervolgens hoe nauwkeurig deze nieuwe activatiemethode was. Ze ontdekten dat het eiwit nog steeds het verschil kon zien tussen zeer vergelijkbare genetische sequenties. Als de korte RNA en het doel-DNA niet perfect overeenkwamen in het midden, zou het eiwit niet snijden. Echter, als de mismatch aan de uiterste uiteinden van de sequentie zat, was het eiwit toleranter. Dit suggereert dat het eiwit nog steeds zeer voorzichtig is met wat het aanvalt, zelfs zonder zijn gebruikelijke gids. Ze ontdekten ook dat het type DNA dat het eiwit snijt anders is in deze nieuwe modus. Terwijl het standaard systeem voorkeur geeft aan bepaalde typen DNA-reporters, werkt deze nieuwe methode het beste met DNA-sequenties die rijk zijn aan een specifieke bouwsteen genaamd cytosine. Deze verschuiving in voorkeur geeft aan dat de interne omgeving van het eiwit is veranderd, wat de interactie met de doelwitten beïnvloedt.

De implicaties van deze ontdekking zijn aanzienlijk voor de manier waarop we ziekten zouden kunnen detecteren. Omdat het systeem de complexe gids-RNA of het specifieke herkenningspunt niet meer nodig heeft, kan het veel eenvoudiger te gebruiken zijn. De onderzoekers bouwden een nieuw diagnostisch platform genaamd COMPANION, dat deze crRNA-onafhankelijke activatie gebruikt om minuscule hoeveelheden viraal genetisch materiaal te vinden. Ze toonden aan dat dit systeem respiratoire virussen, zoals influenza en het respiratoir syncytieel virus, rechtstreeks uit patiëntmonsters kan detecteren zonder dat het genetisch materiaal eerst geamplificeerd hoeft te worden. In tests met echte patiëntmonsters kwam het systeem overeen met de nauwkeurigheid van standaard laboratoriumtests, waarbij positieve en negatieve gevallen met hoge betrouwbaarheid correct werden geïdentificeerd. Het werkte zelfs goed in complexe vloeistoffen zoals speeksel, wat suggereert dat het gebruikt kan worden voor snelle tests ter plaatse in klinieken of thuis.

Dit werk herdefinieert ons begrip van hoe deze moleculaire machines functioneren. Het laat zien dat het Cas12a-eiwit geen rigide instrument is dat alleen onder één set omstandigheden werkt, maar een dynamisch systeem dat in staat is zich aan te passen aan verschillende inputs. Het vermogen van het eiwit om geactiveerd te worden door een eenvoudig RNA-molecuul, zonder de noodzaak van een gids of een herkenningspunt, opent nieuwe mogelijkheden voor het ontwerpen van eenvoudigere, robuustere instrumenten voor de wetenschap en de geneeskunde. De onderzoekers hebben bewezen dat de regels die dit immuunsysteem beheersen flexibeler zijn dan voorheen gedacht, waarmee een verborgen pad wordt onthuld dat het eiwit kan gebruiken om de cel te beschermen of, in de handen van wetenschappers, om ziekten met opmerkelijke snelheid en gevoeligheid te detecteren.