CRISPR RNA-independent activation of Cas12a

In den Zellen fast jedes Lebewesens, von Bakterien bis hin zu Menschen, tobt ein ständiger, stiller Krieg gegen eindringende Viren. Um zu überleben, haben Bakterien ein ausgeklügeltes Immunsystem entwickelt, das wie ein molekularer Sicherheitswächter fungiert. Dieses System, bekannt als CRISPR, ermöglicht es der Zelle, sich vergangene Infektionen zu merken und spezifische genetische Codes des Feindes zu erkennen. Wenn ein Virus angreift, setzt die Zelle ein Protein namens Cas12a ein. So wie Wissenschaftler diesen Prozess seit Jahren verstehen, ist das Protein wie ein blinder Soldat, der zwei Dinge benötigt, um zu handeln: eine spezifische Karte, genannt Guide-RNA, die ihm sagt, wo er suchen soll, und ein spezifisches Wahrzeichen auf der DNA des Feindes, genannt PAM-Sequenz, um zu bestätigen, dass er das richtige Ziel gefunden hat. Erst wenn sowohl die Karte als auch das Wahrzeichen vorhanden sind, wacht das Protein auf und beginnt zu schneiden, wodurch das genetische Material des Eindringlings zerstört wird. Diese strikte Anforderung nach sowohl einem Guide als auch einem Wahrzeichen war die Grundlage für die Verwendung dieser Proteine in Laboren zur Editierung von Genen oder zur Erkennung von Krankheiten.

Jahrzehntelang glaubten Forscher, dass diese zweistufige Überprüfung der einzige Weg sei, wie das Protein aktiviert werden könne. Sie nahmen an, dass das Protein ohne die spezifische Guide-RNA und das korrekte Wahrzeichen inaktiv, harmlos und unfähig bliebe, irgendetwas zu schneiden. Dieser Glaube prägte die Art und Weise, wie Wissenschaftler Werkzeuge entwarfen, um Viren oder Mutationen zu finden, indem sie stets sicherstellten, dass sie sowohl den Guide als auch das Wahrzeichen in ihren Tests einbezogen. Ein neuer Bericht eines Teams von Forschern der University of Toronto, der University of Texas at Austin und anderer Institutionen stellt jedoch diese lang gehegte Ansicht in Frage. Sie entdeckten, dass das Cas12a-Protein viel flexibler ist, als man bisher glaubte. Es benötigt nicht zwingend die traditionelle Guide-RNA oder das spezifische Wahrzeichen, um zu arbeiten. Stattdessen kann das Protein durch ein viel einfacheres, kürzeres Stück RNA aktiviert werden, das direkt in die Bindungstasche des Proteins gleitet und die üblichen Regeln völlig umgeht.

Die Forscher begannen ihre Untersuchung, während sie an einem anderen Diagnosewerkzeug arbeiteten. Sie testeten, wie das Cas1e-Protein auf verschiedene kurze RNA-Sequenzen reagierte. Zu ihrer Überraschung stellten sie fest, dass das Protein zu schneiden begann, selbst als sie die traditionelle Guide-RNA vollständig entfernten. Tatsächlich arbeitete das Protein genauso gut oder manchmal sogar besser, ohne den Guide. Sie identifizierten, dass diese kurzen RNA-Sequenzen, die sie „miniCaRs“ nannten, ausreichten, um das Protein zu wecken. Diese miniCaRs sind winzig, etwa zweiundzwanzig Buchstaben lang, und passen direkt in den Raum, in dem das Protein normalerweise seine Guide-RNA hält. Sob es an der Stelle des miniCaR platziert ist, verändert das Protein leicht seine Form und öffnet seinen Schneidemechanismus. Dies geschieht selbst dann, wenn die Ziel-DNA das spezifische Wahrzeichen vermissen lässt, das zuvor als obligatorisch galt.

Um genau zu verstehen, wie dies geschah, nutzte das Team eine leistungsstarke Bildgebungstechnik namens Kryo-Elektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglichte es ihnen, hochauflösende Schnappschüsse des Proteins in Aktion zu machen. Die Bilder zeigten, dass die Gesamtstruktur des Proteins stark und stabil blieb, aber die Teile, die normalerweise an das Wahrzeichen binden, locker und ungeordnet waren. Das Protein hatte die Anforderung nach dem Wahrzeichen aufgegeben. Stattdessen hielt es eine seltsame Hybridstruktur fest, die aus der kurzen RNA und einem Stück DNA bestand, angeordnet in einer Orientierung, die vom Standardmodell abwich. Der „Deckel“, der normalerweise die Schnittstelle abdeckt, war flexibler und blieb offen, um das Protein dazu zu ermöglichen, in der Nähe befindliche DNA-Stränge zu zerschneiden. Dieser visuelle Beweis bestätigte, dass das Protein einen neuen Weg gefunden hatte, um einzuschalten, der nicht den alten Anweisungen folgte.

Das Team testete dann, wie präzise diese neue Aktivierungsmethode war. Sie fanden heraus, dass das Protein immer noch zwischen sehr ähnlichen genetischen Sequenzen unterscheiden konnte. Wenn die kurze RNA und die Ziel-DNA in der Mitte nicht perfekt übereinstimmten, schnitt das Protein nicht. Wenn die Diskrepanz jedoch an den Enden der Sequenz lag, war das Protein toleranter. Dies deutet darauf hin, dass das Protein immer noch sehr vorsichtig bei dem ist, was es angreift, selbst ohne seinen üblichen Guide. Sie entdeckten auch, dass die Art der DNA, die das Protein schneidet, in diesem neuen Modus anders ist. Während das Standardsystem bestimmte Arten von DNA-Reportern bevorzugt, arbeitet diese neue Methode am besten mit DNA-Sequenzen, die reich an einem spezifischen Baustein namens Cytosin sind. Diese Verschiebung der Präferenz deutet darauf hin, dass sich die interne Umgebung des Proteins verändert hat, was seine Interaktion mit seinen Zielen beeinflusst.

Die Auswirkungen dieser Entdeckung sind bedeutend für die Frage, wie wir Krankheiten erkennen könnten. Da das System weder die komplexe Guide-RNA noch das spezifische Wahrzeichen benötigt, kann es viel einfacher anzuwenden sein. Die Forscher entwickelten eine neue Diagnoseplattform namens COMPANION, die diese crRNA-unabhängige Aktivierung nutzt, um winzige Mengen an viralem genetischem Material zu finden. Sie zeigten, dass dieses System respiratorische Viren, wie Influenza und das respiratorische Synzytial-Virus, direkt aus Patientenproben nachweisen kann, ohne das genetische Material vorher amplifizieren zu müssen. In Tests mit echten Patientenproben erreichte das System die Genauigkeit von Standardlaboruntersuchungen und identifizierte positive sowie negative Fälle mit hoher Zuverlässigkeit. Es funktionierte sogar gut in komplexen Flüssigkeiten wie Speichel, was darauf hindeutet, dass es für schnelle Tests vor Ort in Kliniken oder zu Hause genutzt werden könnte.

Diese Arbeit definiert unser Verständnis darüber, wie diese molekularen Maschinen funktionieren, neu. Sie zeigt, dass das Cas12a-Protein kein starres Werkzeug ist, das nur unter einer bestimmten Bedingung funktioniert, sondern ein dynamisches System, das in der Lage ist, sich an unterschiedliche Inputs anzupassen. Die Fähigkeit des Proteins, durch ein einfaches RNA-Molekül aktiviert zu werden, ohne die Notwendigkeit eines Guides oder eines Wahrzeichens, eröffnet neue Möglichkeiten für das Design einfacherer, robusterer Werkzeuge für die Wissenschaft und Medizin. Die Forscher haben bewiesen, dass die Regeln, die dieses Immunsystem steuern, flexibler sind als bisher angenommen, und sie haben einen verborgenen Pfad aufgedeckt, den das Protein nutzen kann, um die Zelle zu schützen oder – in den Händen von Wissenschaftlern – Krankheiten mit bemerkenswerter Geschwindigkeit und Sensitivität zu erkennen.