CRISPR RNA-independent activation of Cas12a

Dentro das células de quase todos os seres vivos, de bactérias a humanos, há uma guerra constante e silenciosa contra vírus invasores. Para sobreviver, as bactérias desenvolveram um sistema imunológico sofisticado que atua como um segurança molecular. Este sistema, conhecido como CRISPR, permite que a célula se lembre de infecções passadas e reconheça códigos genéticos específicos pertencentes ao inimigo. Quando um vírus ataca, a célula mobiliza uma proteína chamada Cas12a. Da maneira como os cientistas compreenderam este processo durante anos, a proteína é como um soldado cego que precisa de duas coisas para agir: um mapa específico, chamado RNA guia, para lhe dizer onde procurar, e um marco específico no DNA do inimigo, chamado sequência PAM, para confirmar que encontrou o alvo correto. Somente quando tanto o mapa quanto o marco estão presentes é que a proteína desperta e começa a cortar, destruindo o material genético do invasor. Esta exigência rigorosa de ambos, um guia e um marco, tem sido a base para o uso destas proteínas em laboratórios para editar genes ou detetar doenças.

Durante décadas, os investigadores acreditaram que esta verificação de duas etapas era a única forma de a proteína ser ativada. Eles assumiram que, sem o RNA guia específico e o marco correto, a proteína permaneceria dormente, inofensiva e incapaz de cortar qualquer coisa. Esta crença moldou a forma como os cientistas desenharam ferramentas para encontrar vírus ou mutações, garantindo sempre que incluíam tanto o guia como o marco nos seus testes. No entanto, um novo estudo realizado por uma equipa de investigadores da Universidade de Toronto, da Universidade do Texas em Austin e de outras instituições desafia esta visão de longa data. Eles descobriram que a proteína Cas12a é muito mais flexível do que se imaginava. Ela não precisa estritamente do RNA guia tradicional ou do marco específico para começar a trabalhar. Em vez disso, a proteína pode ser ativada por um pedaço de RNA muito mais simples e curto que desliza diretamente para o bolso de ligação da proteína, contornando as regras habituais.

Os investigadores começaram a sua investigação enquanto trabalhavam numa ferramenta de diagnóstico diferente. Estavam a testar como a proteína Cas12a reagia a várias sequências curtas de RNA. Para sua surpresa, descobriram que a proteína começava a cortar mesmo quando removiam completamente o RNA guia tradicional. Na verdade, a proteína funcionava tão bem quanto, ou por vezes melhor do que, sem o guia. Eles identificaram que estas sequências curtas de RNA, que chamaram de "miniCaRs", eram suficientes para despertar a proteína. Estes miniCaRs são minúsculos, tendo cerca de vinte e dois caracteres de comprimento, e encaixam-se diretamente no espaço onde a proteína costuma segurar o seu RNA guia. Uma vez que o miniCaR está no lugar, a proteína muda ligeiramente de forma, abrindo o seu mecanismo de corte. Isto acontece mesmo que o DNA alvo careça da sequência de marco específica que anteriormente se pensava ser obrigatória.

Para compreender exatamente como isto estava a acontecer, a equipa utilizou uma poderosa técnica de imagem chamada criomicroscopia eletrónica. Este método permitiu-lhes tirar fotografias de alta resolução da proteína em ação. As imagens revelaram que a estrutura geral da proteína permanecia forte e estável, mas as partes que normalmente se prendem à sequência do marco estavam soltas e desorganizadas. A proteína tinha largado a exigência do marco. Em vez disso, segurava uma estrutura híbrida estranha formada pelo RNA curto e um pedaço de DNA, arranjados numa orientação que parecia diferente do modelo padrão. A "tampa" que normalmente cobre o local de corte era mais flexível, permanecendo aberta para permitir que a proteína fatiasse outras cadeias de DNA próximas. Esta evidência visual confirmou que a proteína tinha encontrado uma nova forma de se ligar, uma que não seguia as instruções antigas.

A equipa testou então quão precisa era este novo método de ativação. Descobriram que a proteína ainda conseguia distinguir entre sequências genéticas muito semelhantes. Se o RNA curto e o DNA alvo não coincidissem perfeitamente no meio, a proteína não cortaria. No entanto, se a incompatibilidade ocorresse nas extremidades da sequência, a proteína era mais tolerante. Isto sugere que a proteína ainda é muito cuidadosa com o que ataca, mesmo sem o seu guia habitual. Também descobriram que o tipo de DNA que a proteína corta é diferente neste novo modo. Enquanto o sistema padrão prefere certos tipos de repórteres de DNA, este novo método funciona melhor com sequências de DNA ricas num bloco de construção específico chamado citosina. Esta mudança de preferência indica que o ambiente interno da proteína mudou, alterando a forma como interage com os seus alvos.

As implicações desta descoberta são significativas para a forma como podemos detetar doenças. Como o sistema já não necessita do complexo RNA guia ou do marco específico, pode ser muito mais simples de utilizar. Os investigadores construíram uma nova plataforma de diagnóstico chamada COMPANION, que utiliza esta ativação independente de crRNA para encontrar quantidades ínfimas de material genético viral. Eles demonstraram que este sistema pode detetar vírus respiratórios, como a gripe e o vírus sincicial respiratório, diretamente de amostras de pacientes sem necessidade de amplificar o material genético primeiro. Em testes com amostras reais de pacientes, o sistema igualou a precisão dos testes laboratoriais padrão, identificando corretamente casos positivos e negativos com alta fiabilidade. Funcionou inclusive bem em fluidos complexos como a saliva, sugerindo que poderia ser usado para testes rápidos no local, em clínicas ou em casa.

Este trabalho redefine a nossa compreensão de como estas máquinas moleculares funcionam. Mostra que a proteína Cas12a não é uma ferramenta rígida que só funciona sob um conjunto de condições, mas sim um sistema dinâmico capaz de se adaptar a diferentes inputs. A capacidade da proteína de ser ativada por uma molécula de RNA simples, sem a necessidade de um guia ou de um marco, abre novas possibilidades para o design de ferramentas mais simples e robustas para a ciência e a medicina. Os investigadores provaram que as regras que governam este sistema imunitário são mais flexíveis do que se pensava anteriormente, revelando um caminho oculto que a proteína pode usar para proteger a célula ou, nas mãos de cientistas, para detetar doenças com rapidez e sensibilidade notáveis.