CRISPR RNA-independent activation of Cas12a

All'interno delle cellule di quasi ogni essere vivente, dai batteri agli esseri umani, esiste una guerra costante e silenziosa contro i virus invasori. Per sopravvivere, i batteri hanno evoluto un sofisticato sistema immunitario che agisce come una guardia giurata molecolare. Questo sistema, noto come CRISPR, permette alla cellula di ricordare le infezioni passate e riconoscere codici genetici specifici appartenenti al nemico. Quando un virus attacca, la cellula schiera una proteina chiamata Cas12a. Nel modo in cui gli scienziati hanno compreso questo processo per anni, la proteina è come un soldato cieco che ha bisogno di due cose per agire: una mappa specifica, chiamata RNA guida, per dirgli dove guardare, e un punto di riferimento specifico sul DNA del nemico, chiamato sequenza PAM, per confermare di aver trovato il bersaglio corretto. Solo quando sia la mappa che il punto di riferimento sono presenti, la proteina si risveglia e inizia a tagliare, distruggendo il materiale genetico dell'invasore. Questo rigoroso requisito di un guida e di un punto di riferimento è stato la base per l'uso di queste proteine nei laboratori per modificare i geni o rilevare malattie.

Per decenni, i ricercatori hanno creduto che questo controllo in due fasi fosse l'unico modo in cui la proteina potesse essere attivata. Assumevano che senza il particolare RNA guida e il corretto punto di riferimento, la proteina sarebbe rimasta dormiente, innocua e incapace di tagliare qualsiasi cosa. Questa convinzione ha plasmato il modo in cui gli scienziati progettano strumenti per trovare virus o mutazioni, assicurandosi sempre di includere sia la guida che il punto di riferimento nei loro test. Tuttavia, un nuovo studio condotto da un team di ricercatori dell'Università di Toronto, dell'Università del Texas ad Austin e di altre istituzioni sfida questa visione di lunga data. Hanno scoperto che la proteina Cas12a è molto più flessibile di quanto si fosse realizzato. Non ha strettamente bisogno del tradizionale RNA guida o del punto di riferimento specifico per iniziare a lavorare. Invece, la proteina può essere attivata da un pezzo di RNA molto più semplice e corto che scivola direttamente nella tasca di legame della proteina, aggirando completamente le regole consuete.

I ricercatori hanno iniziato la loro investigazione mentre lavoravano su uno strumento diagnostico differente. Stavano testando come la proteina Cas12a reagiva a varie sequenze di RNA corte. Con loro sorpresa, scoprirono che la proteina iniziava a tagliare anche quando rimuovevano completamente il tradizionale RNA guida.로 In effetti, la proteina funzionava altrettanto bene, o talvolta anche meglio, senza la guida. Identificarono che queste brevi sequenze di RNA, che chiamarono "miniCaRs", erano sufficienti per risvegliare la proteina. Questi miniCaRs sono minuscoli, lunghi circa ventidue lettere, e si adattano direttamente nello spazio in cui la proteina solitamente tiene il suo RNA guida. Una volta che il miniCaR è in posizione, la proteina cambia leggermente forma, aprendo il suo meccanismo di taglio. Ciò accade anche se il DNA bersaglio manca della specifica sequenza di riferimento che si riteneva precedentemente obbligatoria.

Per capire esattamente come ciò stesse accadendo, il team ha utilizzato una potente tecnica di imaging chiamata criomicroscopia elettronica. Questo metodo ha permesso loro di scattare istantanee ad alta risoluzione della proteina in azione. Le immagini hanno rivelato che la struttura complessiva della proteina rimaneva forte e stabile, ma le parti che di solito si agganciano alla sequenza di riferimento erano lasse e disorganizzate. La proteina aveva abbandonato il requisito del punto di riferimento. Invece, manteneva una strana struttura ibrida formata dal breve RNA e da un pezzo di DNA, disposti in un orientamento che appariva diverso dal modello standard. Il "coperchio" che di solito copre il sito di taglio era più flessibile, rimanendo aperto per consentire alla proteina di recidere altri filamenti di DNA nelle vicinanze. Questa prova visiva ha confermato che la proteina aveva trovato un nuovo modo per attivarsi, uno che non seguiva le vecchie istruzioni.

Il team ha poi testato quanto fosse precisa questo nuovo metodo di attivazione. Scoprirono che la proteina poteva ancora distinguere tra sequenze genetiche molto simili. Se l'RNA corto e il DNA bersaglio non corrispondevano perfettamente al centro, la proteina non tagliava. Tuttavia, se la discrepanza era alle estremità della sequenza, la proteina era più tollerante. Ciò suggerisce che la proteina è ancora molto attenta a ciò che attacca, anche senza la sua solita guida. Scoprirono anche che il tipo di DNA che la proteina taglia è diverso in questa nuova modalità. Mentre il sistema standard preferisce certi tipi di reporter di DNA, questo nuovo metodo funziona meglio con sequenze di DNA ricche di un particolare mattone chiamato citosina. Questo spostamento di preferenza indica che l'ambiente interno della proteina è cambiato, alterando il modo in cui interagisce con i suoi bersagli.

Le implicazioni di questa scoperta sono significative per il modo in cui potremmo rilevare le malattie. Poiché il sistema non necessita più del complesso RNA guida o del punto di riferimento, può essere molto più semplice da utilizzare. I ricercatori hanno costruito una nuova piattaforma diagnostica chiamata COMPANION, che utilizza questa attivazione indipendente da crRNA per trovare minuscole quantità di materiale genetico virale. Hanno dimostrato che questo sistema poteva rilevare virus respiratori, come l'influenza e il virus respiratorio sinciziale, direttamente dai campioni dei pazienti senza dover amplificare prima il materiale genetico. Nei test con campioni reali di pazienti, il sistema ha eguagliato l'accuratezza dei test standard di laboratorio, identificando correttamente i casi positivi e negativi con alta affidabilità. Funzionava bene anche in fluidi complessi come la saliva, suggerendo che potrebbe essere utilizzato per test rapidi sul posto in cliniche o a casa.

Questo lavoro ridefinisce la nostra comprensione di come funzionano queste macchine molecolari. Dimostra che la proteina Cas12a non è uno strumento rigido che funziona solo sotto un set di condizioni, ma un sistema dinamico capace di adattarsi a diversi input. La capacità della proteina di essere attivata da una semplice molecola di RNA, senza la necessità di una guida o di un punto di riferimento, apre nuove possibilità per progettare strumenti più semplici e robusti per la scienza e la medicina. I ricercatori hanno dimostrato che le regole che governano questo sistema immunitario sono più flessibili di quanto si pensasse, rivelando un percorso nascosto che la proteina può utilizzare per proteggere la cellula o, nelle mani degli scienziati, per rilevare malattie con straordinaria velocità e sensibilità.