An integrated in silico and in vitro approach for the identification of potent novel PAD4 inhibitors

Im Immunsystem des Körpers fungiert ein spezieller Typ von weißen Blutkörperchen, das Neutrophil, als eine Art Schnelleinsatzteam, das zu Orten von Infektion oder Verletzung eilt, um Bedrohungen zu neutralisieren. Wenn diese Zellen auf ein schwerwiegendes Problem stoßen, können sie ein dramatisches Selbstopfer vollziehen, das als NETose bekannt ist. Während dieses Prozesses entwirrt das Neutrophil seine eigene DNA und vermischt sie mit toxischen Enzymen, um eine klebrige, netzartige Falle auszustoßen, die eindringende Mikroben einfängt und tötet. Dieser Mechanismus ist für das Überleben lebenswichtig, aber wenn er außer Kontrolle gerät, können dieselben Netze, die Bakterien töten, auch das eigene Gewebe des Körpers schädigen. Diese übermäßige Freisetzung von zellulärem Debris ist mit einer Vielzahl schwerer Erkrankungen verbunden, einschließlich schwerer Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und Organversagens. Der chemische Schalter, der dieses Entwirren auslöst, ist ein Enzym namens PAD4, das wie ein molekularer Schneider wirkt, indem es Proteine modifiziert, um die engen DNA-Windungen innerhalb der Zelle zu lockern. Wenn es Wissenschaftlern gelänge, einen Weg zu finden, diesen spezifischen Schalter auszuschalten, könnten sie möglicherweise verhindern, dass sich die schädlichen Netze überhaupt erst bilden, was potenziell Krankheiten behandeln könnte, bei denen Entzündungen außer Kontrolle geraten.

Forscher haben nun einen bedeutenden Schritt zur Suche nach einer solchen Lösung unternommen, indem sie die Kraft moderner Computermodellierung mit traditioneller Laborprüfung kombiniert haben. Anstatt Millionen von Chemikalien einzeln zu testen, was langsam und teuer ist, nutzte das Team künstliche Intelligenz, um eine massive digitale Bibliothek von fast einer halben Million potenzieller Wirkstoffkandidaten zu durchsuchen. Sie konzentrierten ihre Suche auf eine spezifische Tasche des PAD4-Enzyms, die von bisherigen Wirkstoffjägern übersehen worden war, auf der Suche nach Molekülen, die passgenau in diesen Raum passen und die Aktivität des Enzyms blockieren könnten. Die Computermodelle, geleitet von Machine-Learning-Algorithmen, sagten voraus, welche Moleküle am festesten an das Ziel binden würden. Aus diesem riesigen digitalen Pool grenzte das System das Feld auf nur fünfundzwanzig vielversprechende Kandidaten ein, die dann physisch im Labor getestet wurden.

Die Ergebnisse dieses Screenings waren beeindruckend. Zwei der ausgewählten Verbindungen, bezeichnet als 16 und 24, erwiesen sich als außergewöhnlich effektiv beim Stoppen des PAD4-Enzyms. In Labortests unter Verwendung zellfreier Systeme waren diese neuen Moleküle weitaus potenter als die derzeitige Standardbehandlung, ein Medikament namens Cl-Amidin. Während das Standardmedikament eine Konzentration von etwa 6,45 Mikromolar benötigte, um ein gewisses Maß an Hemmung zu erreichen, erzielte Verbindung 16 einen ähnlichen oder besseren Effekt bei nur 0,81 Mikromolar, und Verbindung 24 funktionierte bei 3,07 Mikromolar. Das bedeutet, dass die neuen Verbindungen signifikant stärker sind und viel kleinere Mengen benötigen, um dieselbe Aufgabe zu erfüllen. Entscheidend war, dass die Forscher auch überprüften, ob diese starken Inhibitoren sicher für die Zellen waren, die sie schützen sollten. Sie fanden heraus, dass selbst bei hohen Konzentrationen von bis zu 100 Mikromolar die neuen Verbindungen die in den Experimenten verwendeten menschlichen Zellen nicht abtöteten, während das Standardmedikament bereits bei viel niedrigeren Werten Toxizität zeigte. Dies deutet darauf hint, dass die neuen Moleküle eine viel größere Sicherheitsmarge besitzen, ein kritischer Faktor für jedes potenzielle zukünftige Medikament.

Als das Team dazu überging zu testen, wie diese Verbindungen den eigentlichen Prozess der NETose beeinflussen, bestätigten die Ergebnisse weiterhin deren Potenzial. Sie verwendeten menschliche Zellen, die darauf trainiert worden waren, sich wie Neutrophile zu verhalten, und stimulierten sie zur Freisetzung ihrer DNA-Netze. In den unbehandelten Zellen bildeten sich die Netze freiwillig und leuchteten unter einem Mikroskop hell auf, während sie die Umgebung einfingen. Jedoch wurde die Bildung dieser Netze durch die Vorbehandlung der Zellen mit den Verbindungen 16 und 24 drastisch reduziert. Die Zellen behielten ihre strukturelle Integrität bei, und die Freisetzung von toxischen Enzymen und DNA-Fragmenten wurde unterdrückt. Die Forscher bestätigten dies durch die Messung spezifischer Marker, die mit dem Prozess assoziiert sind, wie etwa citrullinierte Histone und Neutrophile Elastase, die in den behandelten Zellen alle signifikant niedriger waren. Dies bestätigte, dass die Verbindungen erfolgreich die chemische Kaskade stoppten, die zur destruktiven Freisetzung zellulärer Inhalte führt.

Die Studie beschränkte sich nicht nur auf die Neutrophilen; sie untersuchte auch die Welleneffekte dieser Hemmung auf andere Immunzellen. Neutrophile, die ihre Netze freigesetzt haben, können in benachbartes Gewebe wandern und eine zweite Welle der Entzündung auslösen, indem sie Makrophagen aktivieren, einen anderen Typ von Immunzelle. Diese Makrophagen werden, wenn sie den Netzen ausgesetzt sind, oft überaktiv und setzen ihre eigenen Entzündungssignale frei sowie produzieren schädliche Mengen an oxidativem Stress. Die Forscher isolierten die Netze von Neutrophilen, die mit den neuen Verbindungen behandelt worden waren, und führten sie Makrophagen zu. Sie fanden heraus, dass die Makrophagen, die diesen „gezähmten“ Netzen ausgesetzt waren, ruhig blieben. Sie zeigten nicht die Anzeichen von Stress oder Aktivierung, die bei Zellen beobachtet wurden, die unbehandelten Netzen ausgesetzt waren. Speziell wurden die Werte reaktiver Sauerstoffspezies und die Expression von Entzündungsmarkern niedrig gehalten, was darauf hindeutete, dass durch das Stoppen der Neutrophile bei der Freisetzung ihrer Netze die neuen Verbindungen auch die anschließende entzündliche Schädigung des umliegenden Gewebes verhinderten.

Diese Arbeit demonstriert einen klaren Pfad von der Computersimulation zur biologischen Realität, indem sie zwei neuartige Moleküle identifiziert, die das PAD4-Enzym effektiv blockieren können, ohne die Zellen zu schädigen. Durch die gezielte Ansprache einer spezifischen, weniger erforschten Region des Enzyms fanden die Forscher Verbindungen, die nicht nur potenter als bestehende Behandlungen sind, sondern auch sicherer für die Zellen sind, mit denen sie interagieren. Die Studie bestätigt, dass die Hemmung von PAD4 den Kreislauf der Entzündung durchbrechen kann, indem sie sowohl die anfängliche Freisetzung der Neutrophilen-Netze als auch die sekundäre Entzündungsreaktion in Makrophagen stoppt. Obwohl diese Ergebnisse derzeit auf Laborbedingungen beschränkt sind, bieten sie eine starke Grundlage für die Entwicklung neuer Therapien, die Patienten, die unter übermäßiger Entzündung und Gewebeschäden leiden, eines Tages helfen könnten. Die nächsten Schritte werden darin bestehen, diese Verbindungen in komplexen lebenden Systemen zu testen, um zu sehen, ob sie diese Laborerfolge in reale medizinische Behandlungen übertragen können.