An integrated in silico and in vitro approach for the identification of potent novel PAD4 inhibitors

In het immuunsysteem van het lichaam fungeert een specifiek type witte bloedcel, genaamd een neutrofiel, als een snelle interventieteam dat naar locaties van infectie of letsel haast om dreigingen te neutraliseren. Wanneer deze cellen een ernstig probleem tegenkomen, kunnen ze een dramatische zelfopoffering uitvoeren die bekend staat als NETose. Tijdens dit proces ontrafelt de neutrofiel zijn eigen DNA en mengt dit met toxische enzymen, waarbij hij een kleverige, webachtige val afschiet om binnendringende microben te vangen en te doden. Dit mechanisme is essentieel voor overleving, maar wanneer het in overdrive gaat, kunnen dezelfde webben die bacteriën doden, ook het eigen weefsel van het lichaam beschadigen. Deze excessieve vrijgave van cellulair afval wordt gekoppeld aan een breed scala aan ernstige aandoeningen, waaronder ernstige ontstekingen, auto-immuunziekten en orgaanfalen. De chemische schakelaar die dit ontrafelen activeert, is een enzym genaamd PAD4, dat werkt als een moleculaire schaar door eiwitten te modificeren om de strakke DNA-coils binnen de cel te versoepelen. Als wetenschappers een manier zouden vinden om deze specifieke schakelaar uit te zetten, zouden ze de schadelijke webben misschien al in de kiem kunnen smoren, wat potentieel kan helpen bij de behandeling van ziekten waarbij ontstekingen de controle verliezen.

Onderzoekers hebben nu een belangrijke stap gezet richting het vinden van een dergelijke oplossing door de kracht van moderne computermodellering te combineren met traditionele laboratoriumtesten. In plaats van miljoenen chemicaliën één voor één te testen, wat traag en duur is, gebruikte het team kunstmatige intelligentie om door een enorme digitale bibliotheek van bijna een half miljoen potentiële medicijnkandidaten te zoeken. Ze richtten hun zoektocht op een specifieke holte van het PAD4-enzym die eerder over het hoofd was gezien door medicijnjagers, op zoek naar moleculen die nauwkeurig in deze ruimte pasten en de activiteit van het enzym konden blokkeren. De computermodellen, gestuurd door machine learning-algoritmen, voorspelden welke moleculen het sterkst aan het doelwit zouden binden. Vanuit deze enorme digitale poel verkleinde het systeem het veld tot slechts vijfentwintig veelbelovende kandidaten, die vervolgens fysiek in het laboratorium werden getest.

De resultaten van deze screening waren opmerkelijk. Twee van de geselecteerde verbindingen, aangeduid als 16 en 24, bleken uitzonderlijk effectief in het stoppen van het PAD4-enzym. In laboratoriumtests met celvrije systemen waren deze nieuwe moleculen veel krachtiger dan de huidige standaardbehandeling, een medicijn bekend als Cl-amidine. Terwijl het standaardmedicijn een concentratie van ongeveer 6,45 micromolair vereiste om een bepaald niveau van inhibitie te bereiken, bereikte verbinding 16 een vergelijkbaar of beter effect bij slechts 0,81 micromolair, en verbinding 24 werkte bij 3,07 micromolair. Dit betekent dat de nieuwe verbindingen aanzienlijk sterker zijn en veel kleinere hoeveelheden vereisen om hetzelfde werk te doen. Cruciaal was dat de onderzoekers ook controleerden of deze krachtige remmers veilig waren voor de cellen die ze bedoeld waren te beschermen. Ze ontdekten dat zelfs bij hoge concentraties tot 100 micromolair de nieuwe verbindingen de menselijke cellen die in de experimenten werden gebruikt, niet doodden, terwijl het standaardmedicijn al bij veel lagere niveaus toxiciteit vertoonde. Dit suggereert dat de nieuwe moleculen een veel grotere veiligheidsmarge hebben, een cruciale factor voor elk potentieel toekomstig medicijn.

Toen het team overging naar het testen hoe deze verbindingen het eigenlijke proces van NETose beïnvloedden, bevestigden de bevindingen hun potentieel. Ze gebruikten menselijke cellen die getraind waren om zich als neutrofielen te gedragen en stimuleerden hen om hun DNA-webben vrij te geven. In de onbehandelde cellen vormden de webben zich vrijelijk en gloeiden ze helder onder een microscoop terwijl ze de omgeving gevangen namen. Echter, wanneer de cellen vooraf werden behandeld met verbindingen 16 en 24, werd de vorming van deze webben drastisch verminderd. De cellen behielden hun structurele integriteit en de vrijgave van toxische enzymen en DNA-fragmenten werd onderdrukt. De onderzoekers bevestigden dit door de niveaus van specifieke markers die geassocieerd worden met het proces te meten, zoals gecitrunileerde histonen en neutrofiel elastase, die allemaal significant lager waren in de behandelde cellen. Dit bevestigde dat de verbindingen erin slaagden de chemische cascade die leidt tot de destructieve vrijgave van cellulaire inhoud te stoppen.

De studie beperkte zich niet tot de neutrofielen; het verkende ook de rimpeleffecten van deze inhibitie op andere immuuncellen. Neutrofielen die hun webben hebben vrijgegeven, kunnen naar nabijgelegen weefsels reizen en een tweede golf van ontsteking triggeren door macrofagen te activeren, een ander type immuuncel. Deze macrofagen worden, wanneer ze worden blootgesteld aan de webben, vaak overactief en laten hun eigen ontstekingssignalen vrij en produceren schadelijke niveaus van oxidatieve stress. De onderzoekers isoleerden de webben van neutrofielen die waren behandeld met de nieuwe verbindingen en introduceerden deze aan macrofagen. Ze ontdekten dat de macrofagen die werden blootgesteld aan deze "getemde" webben rustig bleven. Ze vertoonden niet de tekenen van stress of activatie die gezien werden bij cellen die werden blootgesteld aan onbehandelde webben. Specifiek werden de niveaus van reactieve zuurstofverbindingen en de expressie van ontstekingsmarkers laag gehouden, wat aangeeft dat door het stoppen van de neutrofielen bij het vrijgeven van hun webben, de nieuwe verbindingen ook de daaropvolgende ontstekingsschade aan omliggende weefsels voorkamen.

Dit werk demonstreert een duidelijke weg van computersimulatie naar biologische realiteit, waarbij twee nieuwe moleculen zijn geïdentificeerd die effectief het PAD4-enzym kunnen blokkeren zonder de cellen te schaden. Door een specifiek, minder verkend gebied van het enzym te targeten, vonden de onderzoekers verbindingen die niet alleen krachtiger zijn dan bestaande behandelingen, maar ook veiliger voor de cellen waarmee ze interageren. De studie bevestigt dat het remmen van PAD4 de cyclus van ontsteking kan doorbreken, waardoor zowel de initiële vrijgave van neutrofiele webben als de secundaire ontstekingsreactie in macrofagen wordt gestopt. Hoewel deze bevindingen momenteel beperkt zijn tot laboratoriumsettings, vormen ze een sterk fundament voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën die patiënten met aandoeningen veroorzaakt door excessieve ontsteking en weefselschade ooit kunnen helpen. De volgende stappen zullen het testen van deze verbindingen in complexe levende systemen omvatten om te zien of zij deze laboratoriumsuccessen kunnen vertalen naar medische behandelingen in de echte wereld.