An integrated in silico and in vitro approach for the identification of potent novel PAD4 inhibitors

Nel sistema immunitario del corpo, un tipo specifico di globulo bianco chiamato neutrofilo agisce come una squadra di pronto intervento, accorrendo rapidamente ai siti di infezione o di lesione per neutralizzare le minacce. Quando queste cellule incontrano un problema serio, possono compiere un drammatico sacrificio di se stesse noto come NETosi. Durante questo processo, il neutrofilo srotola il proprio DNA e lo mescola con enzimi tossici, scagliando fuori una trappola appiccicosa, simile a una ragnatela, per catturare e uccidere i microbi invasori. Questo meccanismo è vitale per la sopravvivenza, ma quando va fuori controllo, le stesse ragnatele che uccidono i batteri possono anche danneggiare i tessuti del corpo stesso. Questo rilascio eccessivo di detriti cellulari è collegato a una vasta gamma di condizioni gravi, tra cui l'infiammazione severa, i disturbi autoimmuni e l'insufficienza d'organo. L'interruttore chimico che innesca questo srotolamento è un enzima chiamato PAD4, che agisce come un tagliatore molecolare, modificando le proteine per allentare le strette spire del DNA all'interno della cellula. Se gli scienziati riuscissero a trovare un modo per spegnere questo interruttore specifico, potrebbero essere in grado di impedire la formazione delle ragnatele dannose fin dall'inizio, potenzialmente trattando malattie in cui l'infiammazione sfugge al controllo.

I ricercatori hanno ora compiuto un passo significativo verso la ricerca di una tale soluzione, combinando il potere della moderna modellazione informatica con i test tradizionali di laboratorio. Invece di testare milioni di sostanze chimiche una per una, un processo lento e costoso, il team ha utilizzato l'intelligenza artificiale per setacciare una massiccia biblioteca digitale di quasi mezzo milione di potenziali candidati farmaceutici. Si sono concentrati la ricerca su una specifica tasca dell'enzima PAD4 che era stata trascurata dai precedenti ricercatori di farmaci, cercando molecole che potessero incastrarsi perfettamente in questo spazio e bloccare l'attività dell'enzima. I modelli informatici, guidati da algoritmi di apprendimento automatico, hanno previsto quali molecole si sarebbero legate più strettamente al bersaglio. Da questo vasto pool digitale, il sistema ha ristretto il campo a soli venticinque candidati promettenti, che sono stati poi testati fisicamente in laboratorio.

I risultati di questo screening sono stati sorprendenti. Due dei composti selezionati, etichettati come 16 e 24, si sono dimostrati eccezionalmente efficaci nel bloccare l'enzima PAD4. Nei test di laboratorio utilizzando sistemi cell-free (privi di cellule), queste nuove molecole sono state molto più potenti dell'attuale trattamento standard, un farmaco noto come Cl-amidine. Mentre il farmaco standard richiedeva una concentrazione di circa 6,45 micromolari per raggiungere un certo livello di inibizione, il composto 16 ha ottenuto un effetto simile o migliore a soli 0,81 micromolari, e il composto 24 ha funzionato a 3,07 micromolari. Ciò significa che i nuovi composti sono significativamente più forti, richiedendo quantità molto minori per svolgere lo stesso lavoro. Fondamentalmente, i ricercatori hanno anche controllato se questi potenti inibitori fossero sicuri per le cellule che dovevano proteggere. Hanno scoperto che, anche ad alte concentrazioni fino a 100 micromolari, i nuovi composti non uccidevano le cellule umane utilizzate negli esperimenti, mentre il farmaco standard mostrava tossicità a livelli molto più bassi. Ciò suggerisce che le nuove molecole abbiano un margine di sicurezza molto più ampio, un fattore critico per qualsiasi potenziale medicina futura.

Quando il team è passato a testare come questi composti influenzassero il processo effettivo di NETosi, i risultati hanno continuato a sostenere il loro potenziale. Hanno utilizzato cellule umane che erano state addestrate a comportarsi come neutrofili e le hanno stimolate a rilasciare le loro ragnatele di DNA. Nelle cellule non trattate, le ragnatele si formavano liberamente, brillando intensamente sotto il microscopio mentre intrappolavano l'ambiente circostante. Tuttavia, quando le cellule venivano pre-trattate con i composti 16 e 24, la formazione di queste ragnatele veniva drasticamente ridotta. Le cellule mantenevano la loro integrità strutturale e il rilascio di enzimi tossici e frammenti di DNA veniva soppresso. I ricercatori hanno confermato questo misurando i livelli di specifici marcatori associati al processo, come le istone citrullinate e l'elastasi neutrofila, tutti significativamente più bassi nelle cellule trattate. Ciò ha confermato che i composti stavano con successo bloccando la cascata chimica che porta al rilascio distruttivo dei contenuti cellulari.

Lo studio non si è fermato ai neutrofili; ha anche esplorato gli effetti a catena di questa inibizione su altre cellule immunitarie. I neutrofili che hanno rilasciato le loro ragnatele possono viaggiare verso i tessuti vicini e innescare una seconda ondata di infiammazione attivando i macrofagi, un altro tipo di cellula immunitaria. Questi macrofagi, quando esposti alle ragnatele, spesso diventano iperattivi, rilasciando i propri segnali infiammatori e producendo livelli dannosi di stress ossidativo. I ricercatori hanno isolato le ragnatele dai neutrofili che erano stati trattati con i nuovi composti e le hanno introdotte nei macrofagi. Hanno scoperto che i macrofagi esposti alle ragnatele "addomestrate" rimanevano calmi. Non mostravano i segni di stress o attivazione visti nelle cellule esposte a ragnatele non trattate. Nello specifico, i livelli di specie reattive dell'ossigeno e l'espressione di marcatori infiammatori sono rimasti bassi, indicando che, impedendo ai neutrofili di rilasciare le loro ragnatele, i nuovi composti hanno anche prevenuto il successivo danno infiammatorio ai tessuti circostanti.

Questo lavoro dimostra un percorso chiaro dalla simulazione informatica alla realtà biologica, identificando due nuove molecole che possono bloccare efficacementamente l'enzima PAD4 senza danneggiare le cellule. Mirando a una regione specifica e meno esplorata dell'enzima, i ricercatori hanno trovato composti che non sono solo più potenti dei trattamenti esistenti, ma anche più sicuri per le cellule con cui interagiscono. Lo studio conferma che l'inibizione di PAD4 può interrompere il ciclo dell'infiammazione, bloccando sia il rilascio iniziale delle ragnatele dei neutrofili sia la successiva risposta infiammatoria nei macrofagi. Sebbene queste scoperte siano attualmente limitate agli ambienti di laboratorio, esse forniscono una solida base per lo sviluppo di nuove terapie che potrebbero un giorno aiutare i pazienti affetti da condizioni guidate da un'infiammazione eccessiva e da danni tissutali. I passi successivi consisteranno nel testare questi composti in sistemi viventi complessi per vedere se possano tradurre questi successi di laboratorio in trattamenti medici reali.