iG6PSnFR: A genetically encoded fluorescent sensor for observing glucose-6-phosphate dynamics in living preparations

In jeder lebenden Zelle befindet sich ein komplexes Netzwerk chemischer Reaktionen, das Nahrung ständig in die Energie umwandelt, die benötigt wird, um das Leben in Bewegung zu halten. Ganz am Anfang dieses Prozesses steht ein Molekül namens Glukose-6-phosphat. Es fungt als zentraler Knotenpunkt, ein kritischer Entscheidungspunkt, an dem die Zelle entscheidet, ob sie Zucker zur unmittelbaren Energiegewinnung verbrennt, ihn für später speichert oder ihn verwendet, um neue Strukturen aufzubauen. Jahrzehntelang hatten Wissenschaftler damit gekämpft, dieses Molekül in Aktion zu beobachten. Traditionelle Methoden erforderten das Einfrieren von Zellen oder deren Aufbrechen, um eine Momentaufnahme zu machen, was bedeutete, dass sie niemals sehen konnten, wie sich die Mengen dieses lebenswichtigen Brennstoffs in Echtzeit veränderten, während eine Zelle auf ihre Umgebung reagierte. Ohne eine Möglichkeit, diese Dynamiken zu beobachten, blieb der präzise Moment, in dem eine Zelle ihre Stoffwechselwerkzeuge umschaltet, ein Rätsel.

Um dies zu lösen, haben Forscher ein neues Werkzeug entwickelt, das es ihnen ermöglicht, die Bewegung und Veränderung von Glukose-6-phosphat in lebenden Organismen zu beobachten. Sie entwickelten einen genetisch kodierten Sensor, ein winziges Protein, das in die DNA einer Zelle programmiert werden kann. Wenn dieser Sensor auf Glukose-6-phosphat trifft, verändert er seine Helligkeit und leuchtet je nach der verwendeten Version entweder heller oder dunkler. Dies ermöglicht es Wissenschaftlern, die unsichtbaren chemischen Verschiebungen zu sehen, während sie geschehen, und die interne Chemie der Zelle in eine sichtbare Lichtshow zu verwandeln, die gefilmt und gemessen werden kann.

Das Team hinter dieser Arbeit, angeführt von Wissenschaftlern des Howard Hughes Medical Institute und der Yale School of Medicine, entwarf zwei verschiedene Versionen dieses Sensors. Eine Version, die sie iG6PSnFR nannten, leuchtet auf, wenn sie an Glukose-6-phosphat bindet, was ein Ansteigen der Anwesenheit des Moleküls signalisiert. Die andere Version, genannt iG6PSnFR-D, macht das Gegenteil; sie wird dunkler, wenn sie auf das Molekül trifft. Durch die Erstellung sowohl eines „Ein“- als auch eines „Aus“-Schalters stellten die Forscher sicher, dass sie Konzentrationsänderungen unabhängig davon detektieren konnten, ob die Werte stiegen oder fielen. Sie bauten diese Sensoren, indem sie ein Protein nahmen, das natürlicherweise an Glukose-6-phosphat bindet, und ein lichtemittierendes Protein in seine Struktur einsetzten. Wenn das Bindungsprotein sich fest um das Zielmolekül schließt, verdreht es den lichtemittierenden Teil, wodurch sich verändert, wie viel Licht es abgibt.

Die Forscher testeten die Sensoren zuerst in einer kontrollierten Laborumgebung unter Verwendung gereinigter Proteine. Sie bestätigten, dass die Sensoren spezifisch auf Glukose-6-phosphat reagierten und andere ähnliche Zuckermoleküle ignorierten, die in einer Zelle vorhanden sein könnten. Sie maßen auch die Reaktionsgeschwindigkeit der Sensoren und fanden heraus, dass sie Änderungen in nur Millisekunden detektieren konnten – schnell genug, um mit dem rasanten Tempo des zellulären Stoffwechsels Schritt zu halten. Entscheidend war, dass sie entdeckten, dass die Sensoren nicht leicht durch Änderungen der Mengen an anorganischem Phosphat verwirrt werden konnten, einem in Zellen häufig vorkommenden Chemikalie, die oft bei anderen Arten von Messungen stört. Diese Spezifität bedeutete, dass die Sensoren eine klare, genaue Messung der Glukose-6-phosphat-Werte selbst in der überfüllten chemischen Umgebung einer lebenden Zelle liefern konnten.

Nachdem die Sensoren im Labor validiert worden waren, ging das Team zu lebenden Zellen über, um zu sehen, wie sie sich in einem realen biologischen Kontext verhielten. Sie führten die Sensoren in menschlichen Zellen ein, die in einer Kulturschale gezüchtet wurden, und setzten diese Zellen dann verschiedenen metabolischen Herausforderungen aus. Als sie die Zellen daran hinderten, Zucker aufzunehmen, zeigten die Sensoren einen rapiden Abfall der Glukose-6-phosphat-Werte, genau wie erwartet. Als sie ein Medikament hinzufügten, das den Zuckerverarbeitungsprozess der Zellen stoppt, zeigten die Sensoren erneut einen schnellen Rückgang. Umgekehrt, als sie den Zellen, die ausgehungert worden waren, wieder Zucker zuführten, leuchteten die Sensoren auf und zeigten, dass die Zellen den Zucker erfolgreich in Glukose-6-phosphat umwandeln. Diese Experimente bewiesen, dass die Sensoren das Auf und Ab dieses Moleküls verfolgen können, während die Zellen auf ihre Umgebung reagieren.

Die Forscher gingen dann noch einen Schritt weiter und testeten die Sensoren in Neuronen, den spezialisierten Zellen, die das Nervensystem bilden. Neuronen sind dafür bekannt, hochaktiv zu sein und eine konstante Energieversorgung zu benötigen. Als das Team die Neuronen mit elektrischen Signalen stimulierte, offenbarten die Sensoren einen sofortigen Abfall der Glukose-6-phosphat-Werte, was darauf hindeutete, dass die Zellen ihre Brennstoffreserven schnell aufbrauchten, um die elektrische Aktivität zu befeuern. Diesem Abfall folgte eine Erholung, als die Zellen ihren Vorrat wieder auffüllten. Durch die Beobachtung dieser Veränderungen in Echtzeit konnte das Team die direkte Verbindung zwischen neuronaler Aktivität und dem Verbrauch von metabolischem Brennstoff sehen – ein Prozess, der mit älteren Methoden zu schnell wäre, um beobachtet werden zu können.

Um zu sehen, ob diese Technologie in einem ganzen lebenden Tier funktionierte, wandten sich die Forscher an den winzigen Fadenwurm C. elegans. Sie manipulierten die Würmer so, dass sie den Sensor in spezifischen Sinnesneuronen produzierten, die auf Änderungen der Salzkonzentration reagieren. Als die Würmer einer plötzlichen Erhöhung der Salzkonzentration ausgesetzt wurden, zeigten die Sensoren in den aktiven Neuronen eine Abnahme von Glukose-6-phosphat, während die Sensoren in den inaktiven Neuronen einen Anstieg zeigten. Dies demonstrierte, dass die Sensoren selbst in einem komplexen, sich bewegenden Tier zwischen verschiedenen metabolischen Zuständen in verschiedenen Teilen des Nervensystems unterscheiden konnten. Die Ergebnisse bestätigten, dass das Werkzeug offenlegen kann, wie sich der Stoffwechsel als Reaktion auf sensorische Eingaben in einem lebenden Organismus verändert.

Das Team wandte die Sensoren auch auf Pankreasinseln an, Zellclustern im Pankreas, die für die Freisetzung von Insulin verantwortlich sind. Diese Zellen müssen die Zuckerwerte im Blut wahrnehmen und darauf reagieren, indem sie Insulin freisetzen, um dem Körper zu helfen, diesen Zucker zu verwerten. Unter Verwendung der Sensoren beobachteten die Forscher, was geschah, als sie die Zuckerkonzentration um diese Zellen herum erhöhten. Sie sahen, dass die Glukose-6-phosphat-Werte schnell anstiegen, gefolgt von einem Anstieg anderer metabolischer Signale und einem Anstieg von Kalzium, was die Freisetzung von Insulin auslöst. Diese Abfolge von Ereignissen, die in Echtzeit erfasst wurde, lieferte ein klares Bild davon, wie die Zellen Zucker wahrnehmen und dieses Signal in eine hormonelle Antwort übersetzen.

Schließlich untersuchten die Forscher die Leber, ein großes Organ, das eine entscheidende Rolle beim Management der Körper-Zucker- und Energiereserven spielt. Die Leber ist nicht einheitlich; Zellen in der Nähe der Blutgefäße, die frisches, sauerstoffreiches Blut bringen, verhalten sich anders als Zellen in der Mitte des Organs. Durch die Injektion der Sensoren in die Lebern lebender Mäuse konnte das Team die Verteilung von Glukose-6-phosphat über das Organ kartieren. Sie fanden heraus, dass Zellen in der Mitte der Leber, die stärker an der Energiespeicherung beteiligt sind, höhere Mengen an Glukose-6-phosphat aufrechterhalten als Zellen in der Nähe der Blutgefäße, die eher auf den Abbau von Zucker zur Energiegewinnung fokussiert sind. Diese räumliche Karte, die erstmals sichtbar wurde, zeigte, dass die metabolische Aktivität über verschiedene Regionen desselben Organs hinweg signifikant variiert.

Die Entwicklung dieser Sensoren markiert einen bedeutenden Fortschritt in der Fähigkeit, den zellulären Stoffwechsel zu beobachten. Indem sie einen Weg bereitstellen, Glukose-6-phosphat in Echtzeit zu beobachten – in lebenden Zellen und ganzen Tieren –, haben die Forscher ein neues Fenster dazu geöffnet, wie Zellen ihr Energiemanagement betreiben. Die Fähigkeit, diese Prozesse während ihres Geschehens zu beobachten, anstatt sie nur aus statischen Momentaufnahmen abzuleiten, bietet ein klareres Verständnis davon, wie Zellen Entscheidungen über die Brennstoffnutzung treffen. Dieses Werkzeug ermöglicht es Wissenschaftlern, die unmittelbaren Folgen metabolischer Verschiebungen zu beobachten, sei es bei einem feuernden Neuron, einer pankreatischen Zelle, die Insulin freisetzt, oder einer Leberzelle, die Energiereserven verwaltet. Während diese Sensoren verfeinert und auf neue Fragen angewendet werden, versprechen sie, die dynamische Natur des Stoffwechsels in Gesundheit und Krankheit zu enthüllen und die unsichtbare Chemie des Lebens in eine sichtbare, verständliche Geschichte zu verwandeln.