iG6PSnFR: A genetically encoded fluorescent sensor for observing glucose-6-phosphate dynamics in living preparations

All'interno di ogni cellula vivente, una complessa rete di reazioni chimiche converte costantemente il cibo nell'energia necessaria per mantenere in movimento la vita. All'inizio di questo processo si trova una molecola chiamata glucosio-6-fosfato. Essa agisce come un hub centrale, un punto di giunzione critico dove la cellula decide se bruciare lo zucchero per l'energia immediata, immagazzinarlo per il futuro o usarlo per costruire nuove strutture. Per decenni, gli scienziati hanno lottato per osservare questa molecola in azione. I metodi tradizionali richiedevano di congelare le cellule o di romperle per scattare un'istantanea, il che significava che non potevano mai vedere come i livelli di questo vitale carburante cambiassero in tempo reale mentre una cellula rispondeva al suo ambiente. Senza un modo per osservare queste dinamiche, il momento preciso in cui una cellula cambia marcia metabolica rimaneva un mistero.

Per risolvere questo problema, i ricercatori hanno sviluppato un nuovo strumento che permette loro di osservare il movimento e il cambiamento del glucosio-6-fosfato all'interno degli organismi viventi. Hanno creato un sensore codificato geneticamente, una minuscola proteina che può essere programmata nel DNA di una cellula. Quando questo sensore incontra il glucosio-6-fosfato, cambia la sua luminosità, brillando più intensamente o più debolmente a seconda della versione utilizzata. Ciò consente agli scienziati di vedere gli spostamenti chimici invisibili mentre accadono, trasformando la chimica interna della cellula in uno spettacolo di luce visibile che può essere filmato e misurato.

Il team dietro questo lavoro, guidato da scienziati dell'Howard Hughes Medical Institute e della Yale School of Medicine, ha progettato due versioni distinte di questo sensore. Una versione, che hanno chiamato iG6PSnFR, si illumina quando si lega al glucosio-6-fosfato, segnalando un aumento della presenza della molecola. L'altra versione, chiamata iG6PSnFR-D, fa l'opposto; si affievolisce quando incontra la molecola. Creando sia un interruttore "on" che un interruttore "off", i ricercatori si sono assicurati di poter rilevare i cambiamenti di concentrazione indipendentemente dal fatto che i livelli stiano aumentando o diminuendo. Hanno costruito questi sensori prendendo una proteina che cattura naturalmente il glucosio-6-fosfato e inserendo una proteina emittente luce nella sua struttura. Quando la proteina di legame si chiude attorno alla molecola bersaglio, torce la parte emittente luce, cambiando quanta luce emette.

I ricercatori hanno prima testato i sensori in un ambiente di laboratorio controllato utilizzando proteine purificate. Hanno confermato che i sensori reagivano specificamente al glucosio-6-fosfato e ignoravano altre molecole di zucchero simili che potrebbero essere presenti in una cellula. Hanno anche misurato la velocità con cui i sensori rispondevano, scoprendo che potevano rilevare i cambiamenti in pochi millisecondi, abbastanza velocemente da tenere il passo con il ritmo rapido del metabolismo cellulare. Fondamentalmente, hanno scoperto che i sensori non venivano facilmente confusi dai cambiamenti nei livelli di fosfato inorganico, una sostanza chimica comune nelle cellule che spesso interferisce con altri tipi di misurazioni. Questa specificità significava che i sensori potevano fornire una lettura chiara e accurata dei livelli di glucosio-6-fosfato anche nell'ambiente chimico affollato di una cellula vivente.

Con i sensori validati in laboratorio, il team si è spostato sulle cellule viventi per vedere come si comportassero in un contesto biologico reale. Hanno introdotto i sensori in cellule umane coltivate in una piastra e hanno poi sottoposto quelle cellule a varie sfide metaboliche. Quando hanno bloccato l'assorbimento di zucchero da parte delle cellule, i sensori hanno mostrato un rapido calo dei livelli di glucosio-6-fosfato, esattamente come previsto. Quando hanno aggiunto un farmaco che blocca l'elaborazione dello zucchero da parte delle cellule, i sensori hanno mostrato nuovamente un rapido declino. Al contrario, quando hanno reintrodotto lo zucchero in cellule che erano state affamate, i sensori si sono illuminati, mostrando che le cellule stavano convertendo con successo lo zucchero in glucosio-6-fosfato. Questi esperimenti hanno dimostrato che i sensori potevano tracciare l'andamento del flusso di questa molecola mentre le cellule reagivano al loro ambiente.

I ricercatori hanno poi portato il lavoro un passo avanti, testando i sensori nei neuroni, le cellule specializzate che compongono il sistema nervoso. I neuroni sono noti per essere altamente attivi e richiedono un costante approvigionamento di energia. Quando il team ha stimolato questi neuroni con segnali elettrici, i sensori hanno rivelato un calo immediato dei livelli di glucosio-6-fosfato, indicando che le cellule stavano consumando rapidamente le loro riserve di carburante per alimentare l'attività elettrica. Questo calo è stato seguito da un recupero man mano che le cellule reintegravano la loro scorta. Osservando questi cambiamenti in tempo reale, il team ha potuto vedere il legame diretto tra l'attività neuronale e il consumo di carburante metabolico, un processo che avviene troppo velocemente per essere visto con i metodi più vecchi.

Per vedere se questa tecnologia funzionasse in un animale vivente, i ricercatori si sono rivolti al minuscolo verme tondo C. elegans. Hanno ingegnerizzato i vermi per produrre il sensore in specifici neuroni sensoriali che rispondono alle variazioni di concentrazione salina. Quando i vermi sono stati esposti a un improvviso aumento di sale, i sensori nei neuroni attivi hanno mostrato una diminuzione di glucosio-6-fosfato, mentre i sensori nei neuroni inattivi hanno mostrato un aumento. Ciò ha dimostrato che, anche in un animale complesso e in movimento, i sensori potevano distinguere tra diversi stati metabolici in diverse parti del sistema nervoso. I risultati hanno confermato che lo strumento poteva rivelare come il metabolismo cambi in risposta agli stimoli sensoriali in un organismo vivente.

Il team ha anche applicato i sensori alle isole pancreatiche, gruppi di cellule nel pancreas responsabili del rilascio di insulina. Queste cellule devono percepire i livelli di zucchero nel sangue e rispondere rilasciando insulina per aiutare il corpo a utilizzare quello zucchero. Utilizzando i sensori, i ricercatori hanno osservato cosa accadeva quando aumentavano la concentrazione di zucchero intorno a queste cellule. Hanno visto che i livelli di glucosio-6-fosfato aumentavano rapidamente, seguiti da un aumento di altri segnali metabolici e da un picco di calcio, che innesca il rilascio di insulina. Questa sequenza di eventi, catturata in tempo reale, ha fornito un quadro chiaro di come le cellule percepiscano lo zucchero e traducano quel segnale in una risposta ormonale.

Infine, i ricercatori hanno esaminato il fegato, un organo grande che gioca un ruolo fondamentale nella gestione delle riserve di zucchero ed energia del corpo. Il fegato non è uniforme; le cellule vicino ai vasi sanguigni che portano sangue fresco ricco di ossigeno si comportano diversamente dalle cellule vicino al centro dell'organo. Iniettando i sensori nei fegati di topi vivi, il team è stato in grado di mappare la distribuzione del glucosio-6-fosfato attraverso l'organo. Hanno scoperto che le cellule vicino al centro del fegato, che sono più coinvolte nello stoccaggio dell'energia, mantenevano livelli più elevati di glucosio-6-fosfato rispetto alle cellule vicino ai vasi sanguigni, che sono più focalizzate sulla scomposizione dello zucchero per l'energia. Questa mappa spaziale, visibile per la prima volta, ha mostrato che l'attività metabolica varia significativamente tra le diverse regioni dello stesso organo.

Lo sviluppo di questi sensori segna un passo avanti significativo nella capacità di osservare il metabolismo cellulare. Fornendo un modo per osservare il cambiamento del glucosio-6-fosfato in tempo reale, in cellule viventi e animali interi, i ricercatori hanno aperto una nuova finestra su come le cellule gestiscono la loro energia. La capacità di vedere questi processi mentre accadono, piuttosto che limitarsi a inferirli da istantanee statiche, offre una comprensione più chiara di come le cellule prendano decisioni sull'uso del carburante. Questo strumento permette agli scienziati di osservare le conseguenze immediate dei cambiamenti metabolici, che si tratti di un neurone che trasmette un segnale elettrico, di una cellula pancreatica che rilascia insulina o di una cellula epatica che gestisce lo stoccaggio dell'energia. Man mano che questi sensori vengono perfezionati e applicati a nuove domande, promettono di rivelare la natura dinamica del metabolismo nella salute e nella malattia, trasformando la chimica invisibile della vita in una storia visibile e comprensibile.