iG6PSnFR: A genetically encoded fluorescent sensor for observing glucose-6-phosphate dynamics in living preparations

In elke levende cel bevindt zich een complex netwerk van chemische reacties die constant voedsel omzetten in de energie die nodig is om het leven in beweging te houden. Aan het begin van dit proces ligt een molecuul genaamd glucose-6-fosfaat. Het fungeert als een centraal knooppunt, een kritieke kruising waar de cel beslist of hij suiker verbrandt voor directe kracht, het opslaat voor later, of gebruikt om nieuwe structuren te bouwen. Decennialang hebben wetenschappers geprobeerd dit molecuul in actie te zien. Traditionele methoden vereisten het invriezen van cellen of het uit elkaar halen ervan om een momentopname te maken, wat betekende dat ze nooit konden zien hoe de niveaus van deze vitale brandstof veranderden terwijl een cel reageerde op zijn omgeving in realtime. Zonder een manier om deze dynamiek te observeren, bleef het precieze moment waarop een cel van metabole versnelling wisselt een mysterie.

Om dit op te lossen, hebben onderzoekers een nieuwe tool ontwikkeld waarmee ze kunnen zien hoe glucose-6-fosfaat beweegt en verandert binnen levende organismen. Ze creëerden een genetisch gecodeerde sensor, een piepklein eiwit dat in het DNA van een cel geprogrammeerd kan worden. Wanneer deze sensor glucose-6-fosfaat tegenkomt, verandert de helderheid, waarbij hij feller of juist doffer wordt, afhankelijk van de gebruikte versie. Hierdoor kunnen wetenschappers de onzichtbare chemische verschuivingen zien terwijl ze plaatsvinden, waardoor de interne chemie van de cel wordt omgezet in een zichtbare lichtshow die gefilmd en gemeten kan worden.

Het team achter dit werk, geleid door wetenschappers van het Howard Hughes Medical Institute en de Yale School of Medicine, ontwierp twee verschillende versies van deze sensor. Eén versie, die zij iG6PSnFR noemden, licht op wanneer deze bindt aan glucose-6-fosfaat, wat wijst op een toename van de aanwezigheid van het molecuul. De andere versie, genaamd iG6PSnFR-D, doet het tegenovergestelde; deze dimt wanneer hij het molecuul tegenkomt. Door zowel een "aan"-schakelaar als een "uit"-schakelaar te creëren, zorgden de onderzoekers ervoor dat ze veranderingen in concentratie konden detecteren, ongeacht of de niveaus stegen of daalden. Ze bouwden deze sensoren door een eiwit te nemen dat van nature glucose-6-fosfaat grijpt en een lichtgevend eiwit in de structuur ervan in te voegen. Wanneer het bindingsproteïne zich rond het doelmolecuul sluit, draait het het lichtgevende deel, waardoor de hoeveelheid licht die het afgeeft verandert.

De onderzoekers testten de sensoren eerst in een gecontroleerde laboratoriumsetting met gezuiverde eiwitten. Ze bevestigden dat de sensoren specifiek reageerden op glucose-6-fosfaat en andere soortgelijke suikermoleculen die in een cel aanwezig zouden kunnen zijn negeerden. Ze maten ook hoe snel de sensoren reageerden en vonden dat ze veranderingen in slechts enkele milliseconden konden detecteren, snel genoeg om het snelle tempo van het cellulaire metabolisme bij te houden. Cruciaal was dat ze ontdekten dat de sensoren niet gemakkelijk in verwarring werden gebracht door veranderingen in de niveaus van anorganisch fosfaat, een veelvoorkomend chemisch bestanddeel in cellen dat vaak interfereert met andere soorten metingen. Deze specificiteit betekende dat de sensoren een duidelijke, nauwkeurige meting van de glucose-6-fosfaatniveaus konden geven, zelfs in de drukke chemische omgeving van een levende cel.

Met de sensoren gevalideerd in het lab, gingen de onderzoekers over naar levende cellen om te zien hoe ze presteerden in een echte biologische context. Ze introduceerden de sensoren in menselijke cellen die in een schaal werden gekweekt en onderwierpen die cellen vervolgens aan diverse metabole uitdagingen. Wanneer ze de cellen blokkeerden in het opnemen van suiker, toonden de sensoren een snelle daling van de glucose-6-fosfaatniveaus, precies zoals verwacht. Wanneer ze een medicijn toevoegden dat de cellen stopt met het verwerken van suiker, lieten de sensoren opnieuw een snelle daling zien. Omgekeerd, wanneer ze suiker herintroduceerden aan cellen die uitgehongerd waren, lichtten de sensoren op, wat aantoonde dat de cellen de suiker succesvol omzetten in glucose-6-fosfaat. Deze experimenten bewezen dat de sensoren de eb en vloed van dit molecuul konden volgen terwijl de cellen reageerden op hun omgeving.

De onderzoekers gingen nog een stap verder door de sensoren te testen in neuronen, de gespecialiseerde cellen die het zenuwstelsel vormen. Neuronen staan bekend als zeer actief en hebben een constante aanvoer van energie nodig. Wanneer het team de neuronen stimuleerde met elektrische signalen, onthulden de sensoren een onmiddellijke daling van de glucose-6-fosfaatniveaus, wat erop wees dat de cellen hun brandstofreserves snel verbruikten om de elektrische activiteit aan te drijven. Deze daling werd gevolgd door een herstel terwijl de cellen hun voorraad aanvulden. Door deze veranderingen in realtime te observeren, kon het team de directe link zien tussen neuronale activiteit en het verbruik van metabole brandstof, een proces dat te snel gaat om met oudere methoden te zien.

Om te zien of deze technologie werkte in een heel levend dier, richtten de onderzoekers zich op de kleine rondworm C. elegans. Ze manipuleerden de wormen om de sensor te produceren in specifieke sensorische neuronen die reageren op veranderingen in de zoutconcentratie. Wanneer de wormen werden blootgesteld aan een plotselinge toename van zout, vertoonden de sensoren in de actieve neuronen een afname van glucose-6-fosfaat, terwijl de sensoren in de inactieve neuronen een toename vertoonden. Dit demonstreerde dat de sensoren, zelfs in een complex, bewegend dier, het verschil konden zien tussen verschillende metabole staten in verschillende delen van het zenuwstelsel. De resultaten bevestigden dat het instrument kon onthullen hoe het metabolisme verschuift als reactie op sensorische input in een levend organisme.

Het team paste de sensoren ook toe op pancreas-eilandjes, clusters van cellen in de alvleesklier die verantwoordelijk zijn voor het vrijgeven van insuline. Deze cellen moeten suikergehaltes in het bloed waarnemen en reageren door insuline vrij te geven om het lichaam te helpen deze suiker te gebruiken. Met behulp van de sensoren observeerden de onderzoekers wat er gebeurde toen ze de suikerconcentratie rond deze cellen verhoogden. Ze zagen dat de glucose-6-fosfataatniveaus snel stegen, gevolgd door een stijging van andere metabole signalen en een piek in calcium, wat de afgifte van insuline triggert. Deze opeenvolging van gebeurtenissen, in realtime vastgelegd, gaf een duidelijk beeld van hoe de cellen suiker waarnemen en dit signaal vertalen naar een hormonale respons.

Ten slotte keken de onderzoekers naar de lever, een groot orgaan dat een belangrijke rol speelt bij het beheren van de suiker- en energievoorraden van het lichaam. De lever is niet uniform; cellen nabij de bloedvaten die vers zuurstofrijk bloed aanvoeren, gedragen zich anders dan cellen nabij het centrum van het orgaan. Door de sensoren in de levers van levende muizen te injecteren, was het team in staat om de distributie van glucose-6-fosfaat over het orgaan in kaart te brengen. Ze ontdekten dat cellen nabij het centrum van de lever, die meer betrokken zijn bij de opslag van energie, hogere niveaus van glucose-6-fosfaat behielden dan cellen nabij de bloedvaten, die meer gericht zijn op het afbreken van suiker voor energie. Deze ruimtelijke kaart, voor het eerst zichtbaar gemaakt, toonde aan dat de metabole activiteit aanzienlijk varieert over verschillende regio's van hetzelfde orgaan.

De ontwikkeling van deze sensoren markeert een belangrijke stap voorwaarts in het vermogen om het cellulaire metabolisme te observeren. Door een manier te bieden om glucose-6-fosfaat in realtime te zien veranderen, in levende cellen en hele dieren, hebben de onderzoekers een nieuw venster geopend op hoe cellen hun energie beheren. Het vermogen om deze processen te zien terwijl ze plaatsvinden, in plaats van ze alleen af te leiden uit statische momentopnames, biedt een helderder begrip van hoe cellen beslissingen nemen over het gebruik van brandstof. Deze tool stelt wetenschappers in staat om de onmiddellijke gevolgen van metabole verschuivingen te observeren, of het nu gaat om een neuron dat een elektrisch signaal afgeeft, een pancreascel die insuline vrijgeeft, of een levercel die energieopslag beheert. Naarmen de sensoren worden verfijnd en toegepast op nieuwe vragen, beloven ze de dynamische aard van het metabolisme in gezondheid en ziekte te onthullen, waardoor de onzichtbare chemie van het leven wordt omgezet in een zichtbaar, begrijpelijk verhaal.