Computationally guided modifications of CviUPO to improve catalytic activity

Resumen Técnico: Modificaciones Guiadas Computacionalmente de CviUPO para Mejorar la Actividad Catalítica

Planteamiento del Problema
Las peroxigenasas inespecíficas (UPOs) son biocatalizadores prometedores capaces de oxofuncionalizar selectivamente hidrocarburos saturados utilizando únicamente peróxido de hidrógeno ($H_2O_2$) como cosustrato. Sin embargo, su aplicación industrial se ve obstaculizada por la inactivación enzimática inducida por el peróxido, un proceso que probablemente es desencadenado por radicales hidroxilo que oxidan los aminoácidos en el bolsillo activo. Si bien la ingeniería dirigida de enzimas es esencial para mitigar esto y mejorar el rendimiento, la influencia específica de los aminoácidos del centro activo en el ciclo catalítico aún se comprende poco. Este estudio aborda la necesidad de elucidar cómo las modificaciones en residuos clave del centro activo afectan las barreras de energía y la eficiencia catalítica de la CviUPO (Collariella virescens).

Metodología
Los autores emplearon un flujo de trabajo computacional sinérgico que combina simulaciones de Dinámica Molecular (MD) y cálculos de Mecánica Cuántica/Mecánica Molecular (QM/MM) para investigar dos mutaciones específicas en CviUPO:

1. Glu162 $\to$ Asp162: Reemplazar el ácido glutámico (involucrado en la abstracción de protones) con el más corto ácido aspártico para probar si un mayor volumen de bolsillo mejora la actividad.
2. Cys19 $\to$ His19: Reemplazar la cisteína que ancla el hemo con histidina para investigar la resistencia al blanqueamiento del hemo o un cambio hacia un comportamiento de tipo peroxidasa.

El estudio utilizó las siguientes técnicas computacionales:

• Simulaciones de MD Clásica: Se realizaron simulaciones de 120 ns en la CviUPO nativa, la variante modificada con Asp y la variante modificada con His para evaluar la estabilidad estructural, el volumen del bolsillo activo y la dinámica de hidratación. La estabilidad del sustrato (etilbenceno/ETBE) también se probó mediante MD de 100 ns tras el acoplamiento (docking).
• Simulaciones QM/MM: Utilizando el software ORCA con el funcional B3LYP (base def2-TZVP) y el campo de fuerza CHARMM36, el estudio modeló el ciclo catalítico hasta la formación del Compuesto I (el complejo de hierro-oxo reactivo). Esto incluyó optimizaciones de geometría y análisis de frecuencias para los estados de Bajo Spin (LS), Spin Intermedio (IS) y Alto Spin (HS).
• Simulaciones de Banda Elástica Nudged (NEB): Se realizaron cálculos de CI-NEB para mapear las rutas de mínima energía e identificar las barreras de energía entre los intermediarios clave (Estado Inicial $\to$ Compuesto 0 $\to$ Compuesto I).
• Escaneos de Superficie de Energía Relajados: Realizados para la enzima nativa y la modificada con His con el sustrato en el bolsillo activo para investigar la segunda mitad del ciclo catalítico (Compuesto I $\to$ Compuesto II $\to$ Producto).

Resultos Clave

• Comportamiento Dinámico e Hidratación: Las tres variantes enzimáticas se mantuvieron estables durante los 120 ns. Aunque las modificaciones con Asp y His resultaron en volúmenes de bolsillo activo ligeramente menores en comparación con la enzima nativa, la densidad promedio de moléculas de agua dentro de los bolsillos fue comparable en todas las variantes. Notablemente, la enzima modificada con His mostró una mayor variación temporal en el volumen del bolsillo, lo que sugiere una potencial inestabilidad estructural.
• Formación del Compuesto I (Nativa vs. Modificada):
  • Modificación con Asp: Las simulaciones de NEB revelaron una barrera de energía significativamente aumentada (aprox. 3 eV) para la transición desde el estado inicial al Compuesto 0. Esto se atribuye al residuo de ácido aspártico más corto, que aumenta la distancia que el protón debe viajar desde el $H_2O_2$, dificultando la desprotonación. En consecuencia, se predice que la modificación con Asp es perjudicial para la actividad catalítica.
  • Modificación con His: Los resultados de NEB indicaron que no existe barrera de energía entre el estado inicial y el Compuesto 0, lo que sugiere una formación fácil del complejo de hierro-hidرoperoxo. Sin embargo, la barrera entre el Compuesto 0 y el Compuesto I fue mayor (1.25–1.63 eV) que en la enzima nativa. Además, el estado final (Compuesto I) no fue energéticamente inferior al Compuesto 0, lo que plantea la posibilidad de que el ciclo catalítico pueda quedar atrapado en un mínimo local.
• Estados de Spin: Para las enzimas modificadas, las energías calculadas para los estados LS, IS y HS fueron casi idénticas, lo que indica que pequeños cambios en el entorno electrónico local influyen significativamente en la configuración electrónica preferida. En contraste, la enzima nativa mostró una separación más clara entre los estados de spin, siendo el estado IS el que generalmente presentaba los valores de menor energía.
• Interacción con el Sustrato: Las simulaciones de MD confirmaron que el ETBE es estable en los bolsillos activos de las enzimas nativa y modificada con His, pero inestable en la variante modificada con Asp.
• Ruta de Reacción con el Sustrato: Los escaneos de superficie relajados para la enzima modificada con His mostraron una barrera más baja para la formación del Compuesto II (0.67 eV) en comparación con la enzima nativa (1.37 eV). Sin embargo, el escaneo sugirió una desviación mecánica donde una molécula de agua, en lugar de un rebote directo del grupo hidroxilo, podría facilitar la formación del producto. Esto plantea la posibilidad de que la modificación con His altere el mecanismo de la enzima, potencialmente convirtiéndola de una peroxigenasa a una peroxidasa, aunque esto no se confirmó definitivamente.

Significancia y Reivindicaciones
El artículo concluye que, si bien las simulaciones computacionales lograron elucidar los procesos fundamentales del ciclo catalítico de la CviUPO y destacaron los roles críticos de la hidratación del bolsillo activo y los estados de spin, estas son insuficientes para determinar de manera definitiva si las modificaciones probadas aumentan la actividad catalítica global.

• La modificación con Asp se predice computacionalmente como desfavorable debido a las altas barreras de energía asociadas con la transferencia de protones.
• La modificación con His presenta un compromiso complejo: facilita la formación inicial del complejo de hierro-hidroperoxo, pero introduce barreras más altas más adelante en el ciclo y puede alterar el mecanismo de reacción por completo.
• Los autores enfatizan que las simulaciones por sí solas no pueden determinar con la certeza de la especificidad de sustrato ni confirmar si la modificación con His convierte a la enzima en una peroxidasa. Afirman que se requiere un enfoque sinérgico, que conecte las predicciones teóricas con la verificación experimental, para una ingeniería enzimática eficiente. Los intentos experimentales preliminares para expresar la enzima modificada con His fueron desafiantes, obteniendo cantidades de enzima y carga de hemo bajas, lo que subraya aún más la necesidad de la validación experimental.

Este estudio sirve como una demostración de cómo los cálculos de química cuántica de alto nivel, al integrarse con la dinámica molecular, pueden proporcionar ideas profundas sobre las interacciones electrónicas y los paisajes de energía, guiando futuros esfuerzos de diseño racional mientras se reconocen las limitaciones de las predicciones puramente teóricas.