Computationally guided modifications of CviUPO to improve catalytic activity

Résumé technique : Modifications guidées par calcul de la CviUPO pour améliorer l'activité catalytique

Énoncé du problème
Les peroxygénases non spécifiques (UPO) sont des biocatalyseurs prometteurs capables d'oxyfonctionnaliser sélectivement les hydrocarbures saturés en utilisant uniquement le peroxyde d'hydrogène ($H_2O_2$) comme co-substrat. Cependant, leur application industrielle est entravée par l'inactivation enzymatique induite par le peroxyde, un processus probablement déclenché par des radicaux hydroxyles oxydant les acides aminés dans la poche active. Bien qu'une ingénierie ciblée des enzymes soit essentielle pour atténuer ce phénomène et améliorer les performances, l'influence spécifique des acides aminés du site actif sur le cycle catalytique reste mal comprise. Cette étude répond à la nécessité d'élucider comment les modifications des résidus clés du centre actif affectent les barrières énergétiques et l'efficacité catalytique de la CviUPO (Collariella virescens UPO).

Méthodologie
Les auteurs ont employé un flux de travail computationnel synergique combinant des simulations de dynamique moléculaire (MD) et des calculs de mécanique quantique/mécanique moléculaire (QM/MM) pour étudier deux mutations spécifiques de la CviUPO :

1. Glu162 $\to$ Asp162 : Remplacement de l'acide glutamique (impliqué dans l'abstraction de protons) par l'acide aspartique, plus court, pour tester si l'augmentation du volume de la poche améliore l'activité.
2. Cys19 $\to$ His19 : Remplacement de la cystéine ancrant l'hème par une histidine pour étudier une potentielle résistance au blanchiment de l'hème ou un glissement vers un comportement de type peroxydase.

L'étude a utilisé les techniques de calcul suivantes :

• Simulations de MD classique : Des simulations de 120 ns ont été réalisées sur la CviUPO native, la variante modifiée par l'Asp et la variante modifiée par l'His pour évaluer la stabilité structurelle, le volume de la poche active et la dynamique d'hydratation. La stabilité du substrat (éthylbenzène/ETBE) a également été testée via des simulations MD de 100 ns.
• Simulations QM/MM : Utilisant le logiciel ORCA avec la fonctionnelle B3LYP (base def2-TZVP) et le champ de force CHARMM36, l'étude a modélisé le cycle catalytique jusqu'à la formation du Composé I (le complexe fer-oxo réactif). Cela comprenait des optimisations de géométrie et des analyses de fréquence pour les états de bas spin (LS), de spin intermédiaire (IS) et de haut spin (HS).
• Simulations Nudged Elastic Band (NEB) : Des calculs CI-NEB ont été effectués pour cartographier les chemins d'énergie minimale et identifier les barrières énergétiques entre les intermédiaires clés (État Initial $\to$ Composé 0 $\to$ Composé I).
• Scans de surface d'énergie relaxés : Réalisés pour les enzymes natives et modifiées par l'His avec le substrat dans la poche active afin d'étudier la seconde moitié du cycle catalytique (Composé I $\to$ Composé II $\to$ Produit).

Résultats clés

• Comportement dynamique et hydratation : Les trois variantes enzymatiques sont restées stables sur 120 ns. Bien que les modifications par l'Asp et l'His aient entraîné des volumes de poche active légèrement plus petits par rapport à l'enzyme native, la densité moyenne des molécules d'eau à l'intérieur des poches est restée comparable pour toutes les variantes. Notamment, l'enzyme modifiée par l'His a montré une plus grande variation temporelle du volume de la poche, suggérant une instabilité structurelle potentielle.
• Formation du Composé I (Native vs Modifiée) :
  • Modification par l'Asp : Les simulations NEB ont révélé une barrière énergétique significativement accrue (environ 3 eV) pour la transition de l'état initial vers le Composé 0. Cela est attribué au résidu d'acide aspartique plus court, qui augmente la distance que le proton doit parcourir depuis le $H_2O_2$, entravant ainsi la déprotonation. Par conséquent, la modification par l'Asp est prédite comme étant préjudiciable à l'activité catalytique.
  • Modification par l'His : Les résultats NEB n'ont indiqué aucune barrière énergétique entre l'état initial et le Composé 0, suggérant une formation facile du complexe ferrique hydroperoxo. Cependant, la barrière entre le Composé 0 et le Composé I était plus élevée (1,25–1,63 eV) que dans l'enzyme native. De plus, l'état final (Composé I) n'était pas énergétiquement plus bas que le Composé 0, soulevant la possibilité que le cycle catalytique puisse rester piégé dans un minimum local.
• États de spin : Pour les enzymes modifiées, les énergies calculées pour les états LS, IS et HS étaient presque identiques, indiquant que de faibles changements dans l'environnement électronique local influencent de manière significative la configuration électronique préférée. En revanche, l'enzyme native présentait une séparation plus nette entre les états de spin, l'état IS présentant généralement les valeurs d'énergie les plus basses.
• Interaction avec le substrat : Les simulations MD ont confirmé que l'ETBE est stable dans les poches actives des enzymes natives et modifiées par l'His, mais instable dans la variante modifiée par l'Asp.
• Voie de réaction avec le substrat : Les scans de surface relaxés pour l'enzyme modifiée par l'His ont montré une barrière plus faible pour la formation du Composé II (0,67 eV) par rapport à l'enzyme native (1,37 eV). Cependant, le scan a suggéré une déviation mécanistique où une molécule d'eau, plutôt qu'un rebond direct du groupe hydroxyle, pourrait faciliter la formation du produit. Cela soulève la possibilité que la modification par l'His altère le mécanisme de l'enzyme, la convertissant potentiellement d'une peroxygénase en une peroxydase, bien que cela n'ait pas été définitivement confirmé.

Signification et affirmations
L'article conclut que, bien que les simulations computationnelles aient réussi à élucider les processus fondamentaux du cycle catalytique de la CviUPO et à mettre en évidence les rôles critiques de l'hydratation de la poche active et des états de spin, elles sont insuffisantes pour déterminer de manière définitive si les modifications testées augmentent l'activité catalytique globale.

• La modification par l'Asp est prédite par le calcul comme étant défavorable en raison des barrières énergétiques élevées associées au transfert de protons.
• La modification par l'His présente un compromis complexe : elle facilite la formation initiale du complexe ferrique hydroperoxo mais introduit des barrières plus élevées plus tard dans le cycle et peut altérer entièrement le mécanisme de réaction.
• Les auteurs soulignent que les simulations seules ne peuvent pas déterminer de manière concluante la spécificité de substrat ni confirmer si la modification par l'His convertit l'enzyme en une peroxydase. Ils affirment qu'une approche synergique, reliant les prédictions théoriques à la vérification expérimentale, est nécessaire pour une ingénierie enzymatique efficace. Les tentatives expérimentales préliminaires d'expression de l'enzyme modifiée par l'His ont été difficiles, produisant de faibles quantités d'enzyme et un faible chargement en hème, soulignant davantage la nécessité d'une validation expérimentale.

Cette étude sert de démonstration de la manière dont les calculs de chimie quantique de haut niveau, lorsqu'ils sont intégrés à la dynamique moléculaire, peuvent fournir des informations approfondies sur les interactions électroniques et les paysages énergétiques, guidant ainsi les futurs efforts de conception rationnelle tout en reconnaissant les limites des prédictions purement théoriques.