Computationally guided modifications of CviUPO to improve catalytic activity

Resumo Técnico: Modificações Computacionalmente Guiadas de CviUPO para Melhorar a Atividade Catalítica

Definição do Problema
As peroxigenases inespecíficas (UPOs) são biocatalisadores promissores, capazes de oxifuncionalizar hidrocarbonetos saturados de forma seletiva usando apenas peróxido de hidrogênio ($H_2O_2$) como co-substrato. No entanto, sua aplicação industrial é dificultada pela inativação enzimática induzida por peróxido, um processo provavelmente desencadeado por radicais hidroxila oxidando aminoácidos no bolso ativo. Embora a engenharia direcionada de enzimas seja essencial para mitigar isso e aumentar o desempenho, a influência específica dos aminoácidos do sítio ativo no ciclo catalítico permanece mal compreendida. Este estudo aborda a necessidade de elucidar como as modificações em resíduos-chave do centro ativo afetam as barreiras de energia e a eficiência catalítica da Collariella virescens UPO (CviUPO).

Metodologia
Os autores empregaram um fluxo de trabalho computacional sinérgico combinando simulações de Dinâmica Molecular (MD) e cálculos de Mecânica Quântica/Mecânica Molecular (QM/MM) para investigar duas mutações específicas na CviUPO:

1. Glu162 $\to$ Asp162: Substituindo o ácido glutâmico (envolvido na abstração de prótons) pelo ácido aspártico, que é mais curto, para testar se o aumento do volume do bolso melhora a atividade.
2. Cys19 $\to$ His19: Substituindo a cisteína de ancoragem do heme por histidina para investigar uma potencial resistência ao branqueamento do heme ou uma mudança em direção a um comportamento do tipo peroxidase.

O estudo utilizou as seguintes técnicas computacionais:

• Simulações de MD Clássica: Simulações de 120 ns foram realizadas na CviUPO nativa, modificada com Asp e modificada com His para avaliar a estabilidade estrutural, o volume do bolso ativo e a dinâmica de hidratação. A estabilidade do substrato (etilbenzeno/ETBE) também foi testada via simulações de MD de 100 ns após o docking.
• Simulações QM/MM: Utilizando o software ORCA com o funcional B3LYP (base de conjunto def2-TZVP) e o campo de força CHARMM36, o estudo modelou o ciclo catalítico até a formação do Composto I (o complexo de ferro-oxo reativo). Isso incluiu otimizações de geometria e análises de frequência para os estados de Spin Baixo (LS), Spin Intermediário (IS) e Spin Alto (HS).
• Simulações de Nudged Elastic Band (NEB): Cálculos de CI-NEB foram conduzidos para mapear os caminhos de energia mínima e identificar as barreiras de energia entre os intermediários principais (Estado Inicial $\to$ Composto 0 $\to$ Composto I).
• Varreduras de Superfície de Energia Relaxada: Realizadas para as enzimas nativa e modificada com His com o substrato no bolso ativo para investigar a segunda metade do ciclo catalítico (Composto I $\to$ Composto II $\to$ Produto).

Principais Resultados

• Comportamento Dinâmico e Hidratação: Todas as três variantes enzimáticas permaneceram estáveis durante os 120 ns. Embora as modificações Asp e His tenham resultado em volumes de bolso ativos ligeiramente menores em comparação com a enzima nativa, a densidade média de moléculas de água dentro dos bolsos permaneceu comparável em todas as variantes. Notavelmente, a enzima modificada com His mostrou maior variação temporal no volume do bolso, sugerindo potencial instabilidade estrutural.
• Formação do Composto I (Nativa vs. Modificada):
  • Modificação Asp: As simulações de NEB revelaram uma barreira de energia significativamente aumentada (aprox. 3 eV) para a transição do estado inicial para o Composto 0. Isso é atribuído ao resíduo de ácido aspártico mais curto, que aumenta a distância que o próton deve percorrer a partir do $H_2O_2$, dificultando a desprotonação. Consequentemente, prevê-se que a modificação Asp seja prejudicial à atividade catalítica.
  • Modificação His: Os resultados de NEB indicaram que não há barreira de energia entre o estado inicial e o Composto 0, sugerindo a formação fácil do complexo de ferro(III)-hidroperoxo. No entanto, a barreira entre o Composto 0 e o Composto I foi maior (1,25–1,63 eV) do que na enzima nativa. Além disso, o estado final (Composto I) não foi energeticamente inferior ao Composto 0, levantando a possibilidade de que o ciclo catalítico possa ficar preso em um mínimo local.
• Estados de Spin: Para as enzimas modificadas, as energias calculadas para os estados LS, IS e HS foram quase idênticas, indicando que pequenas mudanças no ambiente eletrônico local influenciam significativamente a configuração eletrônica preferida. Em contraste, a enzima nativa mostrou uma separação mais distinta entre os estados de spin, com o estado IS geralmente exibindo os valores de energia mais baixos.
• Interação com o Substrato: Simulações de MD confirmaram que o ETBE é estável nos bolsos ativos das enzimas nativa e modificada com His, mas instável na variante modificada com Asp.
• Via de Reação com o Substrato: Varreduras de superfície relaxada para a enzima modificada com His mostraram uma barreira menor para a formação do Composto II (0,67 eV) em comparação com a enzima nativa (1,37 eV). No entanto, a varredura sugeriu um desvio mecanístico onde uma molécula de água, em vez de um retorno direto (rebound) do grupo hidroxila, poderia facilitar a formação do produto. Isso levanta a possibilidade de que a modificação His altere o mecanismo da enzima, potencialmente convertendo-a de uma peroxigenase para uma peroxidase, embora isso não tenha sido definitivamente confirmado.

Significância e Alegações
O artigo conclui que, embora as simulações computacionais tenham conseguido elucidar os processos fundamentais do ciclo catalítico da CviUPO e destacado os papéis críticos da hidratação do bolso ativo e dos estados de spin, elas são insuficientes para determinar definitivamente se as modificações testadas aumentam a atividade catalítica global.

• A modificação Asp é computacionalmente prevista como desfavorável devido às altas barreiras de energia associadas à transferência de prótons.
• A modificação His apresenta um compromisso complexo: ela facilita a formação inicial do complexo de ferro(III)-hidroperoxo, mas introduz barreiras mais altas posteriormente no ciclo e pode alterar inteiramente o mecanismo de reação.
• Os autores enfatizam que as simulações sozinhas não podem determinar conclusivamente a especificidade do substrato ou confirmar se a modificação His converte a enzima em uma peroxidase. Eles afirmam que uma abordagem sinérgica, conectando previsões teóricas com verificação experimental, é necessária para uma engenharia de enzimas eficiente. Tentativas experimentais preliminares de expressão da enzima modificada com His foram desafiadoras, resultando em baixas quantidades de enzima e carregamento de heme, o que reforça ainda mais a necessidade de validação experimental.

O estudo serve como uma demonstração de como cálculos químicos quânticos de alto nível, quando integrados com dinâmica molecular, podem fornecer insights profundos sobre interações eletrônicas e paisagens de energia, orientando futuros esforços de design racional enquanto reconhece as limitações de previsões puramente teóricas.