Imaging aerosolized viruses with an X-ray free-electron laser using single-particle rotational invariants

Resumen Técnico: Imagen de Virus Aerosolizados con un Láser de Electrones Libres de Rayos X mediante Invariantes de Rotación de Partícula Única

Planteamiento del Problema
La imagen de partícula única (SPI) utilizando láseres de electrones libres de rayos X (XFEL) permite mediciones de "difracción antes de la destrucción" de biopartículas no cristalinas, como los virus, bajo condiciones cercanas a las biológicamente relevantes. Sin embargo, la falta de invarianza traslacional en objetivos no cristalinos complica significativamente la determinación de la estructura. Los enfoques convencionales dependen de observables directamente accesibles como las intensidades dispersadas $I(q)$, lo que requiere la recuperación de las fases perdidas para reconstruir las densidades de electrones en el espacio real. Aunque existen algoritmos de determinación de fase iterativos, estos suelen tener dificultades con la resolución experimental limitada y la necesidad de restricciones de simetría, lo que puede enmascarar asimetrías estructurales intrínsecas y dinámicas. Además, la caracterización de las variaciones estructurales dentro de los conjuntos de partículas aerosolizadas sigue siendo un desafío debido a la complejidad de alinear orientaciones aleatorias y a la presencia de heterogeneidad ambiental.

Metodología
Este trabajo emplea invariantes de rotación derivados de mediciones de difracción de rayos X para facilitar la determinación de la estructura 3D, tanto guiada por modelos como ab initio, del bacteriófago PR772 aerosolizado.

1. Adquisición de Datos: Se registraron patrones de difracción de partículas PR772 aerosolizadas mediante una pila de lentes aerodinámicas y probadas con pulsos de femtosegundos (1.6 y 1.7 keV) en el Linac Coherent Light Source (LCLS) a través de tres experimentos independientes (amo06516, amo86615, amo11416).
2. Invariantes de Rotación vía XCCA: En lugar de depender únicamente de patrones de difracción individuales, los autores utilizaron el Análisis de Correlación Cruzada de Rayos X Angular (XCCA). Calcularon la función de correlación cruzada angular de dos puntos del patrón de diferencia promedio, $C_{diff}(q, q', \Delta)$, para mejorar la relación señal-ruido y suprimir el fondo.
3. Extracción de Invariantes: Las CCFs se descompusieron en componentes de Fourier, $C_n(q, q')$, que son combinaciones lineales de los invariantes de rotación $B_l(q, q')$. Estos invariantes, definidos como productos de coeficientes de expansión de armónicos esféricos, codifican información estructural intrínseca independiente de la orientación de la partícula.
4. Determinación de la Estructura:
   • Reconstrucción Ab Initio: Se utilizó el algoritmo de Determinación de Fase Iterativa de Múltiples Niveles (MTIP), implementado en la suite de software xFrame, para reconstruir las densidades de electrones 3D a partir de los invariantes $B_l(q, q')$ determinados experimentalmente. Este proceso resuelve simultáneamente las matrices unitarias desconocidas (determinación de orientación) y las fases sin imponer restricciones de simetría.
   • Análisis Guiado por Modelo: Se empleó un enfoque de modelado de esferas (bead-modeling) para simular la difracción de varios modelos estructurales (por ejemplo, icosaedros perfectos, cápsides distorsionadas, estructuras de núcleo-capa). Estas simulaciones generaron invariantes teóricos para comparar con los datos experimentales, permitiendo la verificación de características estructurales específicas como las no uniformidades de densidad y las distorsiones de forma.
5. Regularización: Se aplicaron técnicas de regularización avanzada, incluyendo la equilibración de Ruiz y la aproximación de bajo rango, a los invariantes para mitigar el ruido y los errores numéricos, optimizando los datos para el algoritmo MTIP.

Resultados Clave

• Asimetría Estructural: A pesar de una resolución experimental modesta (que oscila entre 6 y 13 nm dependiendo del conjunto de datos y la métrica), las reconstrucciones ab initio revelaron consistentemente desviaciones de la cápside del PR772 respecto a la simetría icosaédrica perfecta. Estas distorsiones se observaron en los tres experimentos independientes, lo que sugiere que son una propiedad estructural común más que un artefacto de condiciones experimentales específicas.
• Variaciones de Densidad Interna: Las reconstrucciones y el análisis guiado por modelos indicaron distribuciones de densidad no uniformes dentro de las partículas virales. Específicamente, el subconjunto de datos amo06516 mostró una heterogeneidad de densidad interna significativa en comparación con el conjunto amo86615, que parecía más uniforme.
• Extensiones de Vértice: En el subconjunto amo06516, se detectaron tenues extensiones de densidad que emergen de uno de los vértices icosaédricos. Esta característica se asemeja a la protuberancia de nanotubo observada en el virus PRD1 relacionado durante la entrega del genoma, lo que sugiere posibles transformaciones estructurales o heterogeneidad en la muestra.
• Robustez de los Invariantes: Los invariantes de rotación $C_n(q, q')$ demostraron una alta robustez, mostrando una fuerte similitud entre diferentes ejecuciones experimentales y subconjuntos de tamaño de partícula, incluso con variaciones en el número de patrones de difracción.
• Validación de Modelos: Las simulaciones confirmaron que los modelos icosaédricos perfectos no logran reproducir las morfologías de los invariantes experimentales. La introducción de compresión uniaxial radial y distorsiones compuestas (radiales y tangenciales) mejoró significamente el acuerdo con los mapas de fase experimentales, particularmente para los invariantes de orden inferior ($n=2, 4$). Los modelos de núcleo-capa refinaron aún más el ajuste, revelando sensibilidad a la densidad del núcleo interno.

Significado y Reivindicaciones
Los autores afirman que los invariantes de rotación sirven como herramientas poderosas para sondear la estructura y la evolución temporal de nanopartículas y biopartículas utilizando XFELs. Al eliminar los grados de libertad de rotación, estos invariantes proporcionan información estructural extensa que puede utilizarse concurrentemente en el modelado hacia adelante y en la resolución de problemas inversos.

El artículo enfatiza que este enfoque combinado de reconstrucción ab initio y análisis guiado por modelos mejora la fidelidad del análisis estructural, particularmente cuando la resolución experimental es limitada. Crucialmente, el método permite la detección de características estructurales —como las distorsiones asimétricas de la cápside y las no uniformidades de densidad— que podrían quedar ocultas por las restricciones de simetría en los análisis tradicionales de cristalografía o criomicroscopía electrónica. Los resultados sugieren que los virus aerosolizados pueden exhibir asimetrías intrínsecas y variaciones estructurales dinámicas (potencialmente inducidas por cambios ambientales durante la aerosolización o dinámicas de equilibrio inherentes) que son accesibles a través de esta técnica de imagen basada en la correlación. El trabajo demuestra que los invariantes de rotación pueden caracterizar eficazmente las similitudes y las variaciones estructurales dentro de los conjuntos medidos, ofreciendo una vía para estudiar las rutas de transmisión de virus y la dinámica estructural bajo condiciones cercanas a las nativas.