Imaging aerosolized viruses with an X-ray free-electron laser using single-particle rotational invariants

技術要約：回転不変量を用いたX線自由電子レーザーによるエアロゾル化ウイルスのイメージング

問題提起
X線自由電子レーザー（XFEL）を用いた単一粒子イメージング（SPI）は、非結晶性のバイオ粒子（ウイルスなど）に対し、生物学的に近い条件下での「破壊前の回折（diffraction-before-destruction）」測定を可能にする。しかし、非結晶性ターゲットにおける並進不変性の欠如は、構造決定を著しく困難にする。従来のアプローチは、$I(q)$ のような直接観測可能な量に依存しているが、実空間の電子密度を再構成するには失われた位相の回収が必要となる。反復位相決定アルゴтоリズムは存在するものの、実験解像度の制限や対称性の制約に直面することが多く、これらは本質的な構造の非対称性やダイナミクスを隠蔽してしまう可能性がある。さらに、エアロゾル化された粒子アンサンブル内の構造変化を特徴付けることは、ランダムな配向の整列や環境的な不均一性の複雑さから、依然として困難な課題である。

手法
本研究では、エアロゾル化されたバクテリオファージPR772の、モデル誘導型およびab initio（第一原理的）な3次元（3D）構造決定を促進するために、X線回折から得られる回転不変量を採用している。

1. データ取得: エアロダイナミックレンズスタックを介してエアロゾル化されたPR72粒子を用い、Linac Coherent Light Source (LCLS) において、3つの独立した実験（amo06516, amo86615, amo11416）を通じて、フェムト秒XFELパルス（1.6および1.7 keV）を用いて回折パターンを記録した。
2. 回転不変量の算出: 個々の回折パターンのみに依存するのではなく、著者らは角度X線相互相関解析（XCCA）を利用した。信号対雑音比を高め、背景ノイズを抑制するために、平均差分パターンによる2点角度相互相関関数 $C_{diff}(q, q', \Delta)$ を算出した。
3. 不変量の抽出: CCFはフーリエ成分 $C_n(q, q')$ に分解され、これは回転不変量 $B_l(q, q')$ の線形結合である。これらの不変量は、球関数展開係数の積として定義され、粒子の配向に依存しない本質的な構造情報をコードしている。
4. 構造決定:
   • Ab Initio 再構成: xFrame ソフトウェアスイートに実装されている多段階反復位相決定（MTIP）アルゴリズムを用い、実験的に決定された不変量 $B_l(q, q')$ から3D電子密度を再構成した。このプロセスでは、対称性の制約を課すことなく、未知のユニタリ行列（配向決定）と位相を同時に解く。
   • モデル誘導型解析: ビードモデリング手法を用い、様々な構造モデル（完全な二十面体、歪んだカプシド、コア・シェル構造など）からの回折をシミュレートした。これらのシミュレーションにより理論的な不変量を生成し、実験データと比較することで、密度の不均一性や形状の歪みといった特定の構造的特徴の検証を行った。
5. 正則化: ノイズと数値誤差を軽減し、MTIPアルゴリズムへのデータを最適化するために、Ruiz等化や低ランク近似を含む高度な正則化技術を適用した。

主な結果

• 構造の非対称性: 実験解像度が比較的低い（データセットや指標に応じて6〜13 nm）にもかかわらず、ab initio 再構成は、PR772カプシドが完全な二十面体対称性から逸脱していることを一貫して示した。これらの歪みは3つの独立した実験すべてで観察されており、特定の実験条件によるアーティファクトではなく、一般的な構造特性であることを示唆している。
• 内部密度の変動: 再構成およびモデル誘導型解析は、ウイルス粒子内の不均一な密度分布を示した。具体的には、amo06516 データセットは、より均一に見える amo86615 データセットと比較して、顕著な内部密度不均一性を示した。
• 頂点の延長: amo06516 サブセットにおいて、二十面体の頂点の1つから出現する微かな密度の延長が検出された。この特徴は、関連するPRD1ウイルスで見られるナノチューブの突起に類似しており、ゲノム注入時の構造変化や不均一性の可能性を示唆している。
• 不変量の堅牢性: 回転不変量 $C_n(q, q')$ は高い堅牢性を示し、回折パターンの数にばらつきがある場合でも、異なる実験実行間や粒子サイズの部分集合間で強い類似性を示した。
• モデルの検証: シミュレーションにより、完全な二十面体モデルは実験的な不変量の形態を再現できないことが確認された。径方向の単軸圧縮および複合的な歪み（径方向および接線方向）を導入することで、特に低次不変量（$n=2, 4$）において、実験的な位相マップとの一致が大幅に改善された。また、コア・シェルモデルは適合度をさらに向上させ、内部コア密度に対する感度を明らかにした。

意義および主張
著者らは、回転不変量が、XFELを用いたナノ粒子およびバイオ粒子の構造と時間的進化を調査するための強力なツールとして機能すると主張している。回転の自由度を取り除くことで、これらの不変量は、フォワードモデリングと逆問題解決の両方に同時に利用できる広範な構造情報を提供する。

本論文は、ab initio 再構成とモデル誘導型解析を組み合わせたアプローチが、実験解像度が限られている場合でも、構造解析の忠実度を高めることを強調している。決定的なのは、この手法が、従来の結晶学やクライオ電子顕微鏡解析では隠されてしまう可能性のある構造的特徴（非対称なカプシドの歪みや密度の不均一性など）を検出できる点である。これらの結果は、回転不変量が、測定されたアンサンブル内の類似性と構造的変化を効果的に特徴付けることができることを示しており、自然に近い条件下でのウイルス伝播経路や構造ダイナミクスを研究するための道を開くものである。本研究は、回転不変量が、実験的な回折パターンを用いて、アンサンブル内の構造的類似性と変動を効果的に記述できることを実証している。