Imaging aerosolized viruses with an X-ray free-electron laser using single-particle rotational invariants

Technische Samenvatting: Beeldvorming van Aerosoliserende Virussen met een Röntgen Vrije-Elektron Laser Gebruikmakend van Enkel-Deeltje Rotatie-invarianten

Probleemstelling
Single-particle imaging (SPI) met röntgen vrije-elektronen lasers (XFELs) maakt "diffraction-before-destruction" metingen van niet-kristallijne biodeeltjes mogelijk, zoals virussen, onder bijna biologisch relevante condities. Echter, het gebrek aan translationele invariantie bij niet-kristallijne doelwitten compliceert de structurele bepaling aanzienlijk. Conventionele benaderingen vertrouwen op direct toegankelijke observabelen zoals verstrooiingsintensiteiten $I(q)$, waarbij de verloren fasen moeten worden gereconstrueerd om de real-space elektronendichtheid te herstellen. Hoewel iteratieve faseringsalgoritmen bestaan, hebben deze vaak moeite met beperkte experimentele resolutie en de noodzaak van symmetrie-restricties, wat intrinsieke structurele asymmetrieën en dynamiek kan maskeren. Bovendien blijft het karakteriseren van structurele variaties binnen ensembles van aerosoliserende deeltjes een uitdaging vanwege de complexiteit van het uitlijnen van willekeurige oriëntaties en de aanwezigheid van omgevingsheterogeniteit.

Methodologie
Dit werk maakt gebruik van rotatie-invarianten afgeleid van röntgendiffractiemetingen om zowel model-gestuurde als ab initio 3D-structuurbepaling van het aerosoliserende bacteriofaag PR772 te faciliteren.

1. Data-acquisitie: Diffractiepatronen werden opgenomen van PR772-deeltjes die via een aerodynamische lensstapel waren geaerosoliseerd en geprobeerd met femtoseconde XFEL-pulsen (1,6 en 1,7 keV) bij de Linac Coherent Light Source (LCLS) over drie onafhankelijke experimenten (amo06516, amo86615, amo11416).
2. Rotatie-invarianten via XCCA: In plaats van uitsluitend te vertrouwen op individuele diffractiepatronen, gebruikten de auteurs Angular X-ray Cross-Correlation Analysis (XCCA). Zij berekenden de gemiddelde verschil-patroon twee-punts hoekige cross-correlatiefunctie (CCF), $C_{diff}(q, q', \Delta)$, om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en achtergrond te onderdrukken.
3. Extractie van Invarianten: De CCF's werden vervormd naar Fourier-componenten, $C_n(q, q')$, die lineaire combinaties zijn van rotatie-invarianten $B_l(q, q')$. Deze invarianten, gedefinieerd als producten van sferische harmonische expansiecoëfficiënten, coderen intrinsieke structurele informatie die onafhankelijk is van de deeltjesoriëntatie.
4. Structuurbepaling:
   • Ab Initio Reconstructie: Het Multi-Tiered Iterative Phasing (MTIP) algoritme, geïmplementeerd in de xFrame software suite, werd gebruikt om 3D-elektronendichtheden te reconstrueren uit de experimenteel bepaalde invarianten $B_l(q, q')$. Dit proces lost simultaan de onbekende unitaire matrices (oriëntatiebepaling) en fasen op zonder symmetrie-restricties op te leggen.
   • Model-gestuurde Analyse: Een "bead-modeling" benadering werd toegepast om diffractie van diverse structurele modellen (bijv. perfecte icosaëders, gedistorsioneerde capsiden, core-shell structuren) te simuleren. Deze simulaties genereerden theoretische invarianten om te vergelijken met experimentele data, wat de verificatie van specifieke structurele kenmerken zoals dichtheidsnonuniformiteiten en vormdistorties mogelijk maakte.
5. Regularisatie: Geavanceerde regularisatietechnieken, inclusief Ruiz-equilibratie en low-rank benadering, werden toegepast op de invarianten om ruis en numerieke fouten te mitigeren, waardoor de data werd geoptimaliseerd voor het MTIP-algoritme.

Belangrijkste Resultaten

• Structurele Asymmetrie: Ondanks een bescheiden experimentele resolutie (variërend van 6 tot 13 nm afhankelijk van de dataset en metriek), toonden de ab initio reconstructies consistent afwijkingen van de perfecte icosaëdrale symmetrie van de PR772-capside. Deze distorties werden waargenomen in alle drie de onafhankelijke experimenten, wat suggereert dat het een gemeenschappelijk structureel kenmerk is in plaats van een artefact van specifieke experimentele condities.
• Interne Dichtheidsvariaties: De reconstructies en model-gestuurde analyse wezen op niet-uniforme dichtheidsverdelingen binnen de virusdeeltjes. Specifiek vertoonde de amo06516 dataset significante interne dichtheidsheterogeniteit vergeleken met de amo86615 dataset, die meer uniform leek.
• Vertex Extensies: In de amo06516 subset werden zwakke dichtheidsextensies gedetecteerd die uit een van de icosaëdrale vertices voortkomen. Dit kenmerk vertoont gelijkenis met de nanotube-uitstulping waargenomen bij het verwante PRD1-virus tijdens genoomafgifte, wat duidt op potentiële structurele transformaties of heterogeniteit in het monster.
• Robuustheid van Invarianten: De rotatie-invarianten $C_n(q, q')$ vertoonden een hoge robuustheid, met een sterke gelijkenis tussen verschillende experimentele runs en deeltjesgrootte-subsets, zelfs bij variërende aantallen diffractiepatronen.
• Model Validatie: Simulaties bevestigden dat perfecte icosaëdrale modellen er niet in slaagden de experimentele invariant-morfologieën te reproduceren. Het introduceren van radiale uniaxiale compressie en composiet-distorties (radiaal en tangentieel) verbeterde de overeenstemming met de experimentele fasekaarten aanzienlijk, met name voor lagere-orde invarianten ($n=2, 4$). Core-shell modellen verfijnden de fit verder, wat de gevoeligheid voor de interne kern-dichtheid onthulde.

Betekenis en Claims
De auteurs claimen dat rotatie-invarianten krachtige instrumenten zijn voor het onderzoeken van de structuur en de temporele evolutie van nano- en biodeeltjes met behulp van XFELs. Door door rotatie vrij te maken van de vrijheidsgraden, bieden deze invarianten uitgebreide structurele informatie die gelijktijdig kan worden gebruikt voor zowel forward modeling als inverse probleemoplossing.

Het artikel benadrukt dat deze gecombineerde benadering van ab initio reconstructie en model-gestuurde analyse de getrouwheid van structurele analyse verhoogt, vooral wanneer de experimentele resolutie beperkt is. Cruciaal is dat de methode de detectie van structurele kenmerken mogelijk maakt—zoals asymmetrische capsid-distorties en dichtheidsnonuniformiteiten—die door symmetrie-restricties in traditionele kristallografische of cryo-EM analyses zouden kunnen worden verborgen. De resultaten suggereren dat geaerosoliseerde virussen intrinsieke asymmetrieën en dynamische structurele variaties kunnen vertonen (mogelijk geïnduceerd door omgevingsveranderingen tijdens aerosolisatie of inherente evenwichtsdynamiek) die toegankelijk zijn via deze correlatie-gebaseerde beeldvormingstechniek. Dit werk demonstreert dat rotatie-invarianten effectief de gelijkenissen en structurele variaties binnen gemeten ensembles kunnen karakteriseren, wat een pad biedt voor het bestuderen van virustransmissieroutes en structurele dynamica onder bijna-natieve condities.