Effect of Warming Regimen on Canine Epididymal Spermatozoa Following Vitrification Using a Coconut Water Extender Supplemented with Egg Yolk

Resumen Técnico: Efecto del Régimen de Calentamiento en Espermatozoides de Epidídimo Canino tras la Vitrificación

Planteamiento del Problema
La preservación del material genético canino mediante la recuperación de espermatozoides epididimales y la vitrificación es cada vez más vital para los programas de cría y la conservación de germoplasma, particularmente para animales que se someten a orquiectomía, muerte inesperada o gestión de especies en peligro de extinción. Si bien la congelación lenta convencional sigue siendo el estándar para el semen canino, a menudo produce una supervivencia postdescongelación variable. La vitrificación, una técnica de solidificación ultra rápida, ofrece una alternativa prometedora pero requiere la optimización precisa del protocolo. Un factor crítico, aunque poco investigado, en el éxito de la vitrificación es el procedimiento de calentamiento (desvitrificación). Aunque estudios previos han explorado las tasas de calentamiento para el semen canino eyaculado, la influencia específica de diferentes temperaturas de calentamiento lento en los espermatozoides epididimales —que difieren biológicamente del semen eyaculado en composición de membrana y carecen de plasma seminal— sigue sin estar clara. Además, la eficacia de los extensores naturales como el agua de coco, combinados con yema de huevo, específicamente para la vitrificación de espermatozoides epididimales, no se ha establecido plenamente.

Metodología
El estudio utilizó espermatozoides epididimales recolectados de doce perros clínicamente sanos de diversas razas sometidos a una orquiectomía de rutina en la Universidad de Trakia. Los espermatozoides se recuperaron mediante el método de flotación (float-up) de la cauda epididimal y el conducto deferente.

• Formulación del Extensor: Las muestras se procesaron en un extensor basado en agua de coco (50% de agua de coco, 25% de agua destilada, 25% de citrato de monosodio anhidro al 5%) suplementado con 20% de yema de huevo. El agua de coco se obtuvo de cocos verdes certificados orgánicos.
• Vitrificación: Tras un equilibrio a 4°C durante 60 minutos, se vitrificaron alícuotas de 33 µL mediante la colocación directa sobre un colador de acero inoxidable sobre nitrógeno líquido (LN₂). Las muestras se almacenaron en LN₂ durante 7 días.
• Regímenes de Calentamiento: Tras el almacenamiento, las muestras se desvitrificaron utilizando dos protocolos distintos de calentamiento lento, ambos con una duración de 2 minutos:
  1. 37°C: Las muestras se calentaron en medio CaniPlus AI a 37°C.
  2. 42°C: Las muestras se calentaron en medio CaniPlus AI a 42°C.
• Evaluación: La calidad de los espermatozoides se evaluó antes de la vitrificación y después del calentamiento utilizando Análisis de Espermatozoides Asistido por Computadora (CASA) para la motilidad y los parámetros cinéticos (VCL, VSL, VAP, LIN, STR, ALH, BCF), tinción de SpermBlue para la morfología y tinción de eosin-nigrosina para la viabilidad. El análisis estadístico empleó ANOVA de medidas repetidas con la prueba post hoc de Tukey.

Resultos Clave
El estudio demostró que, si bien la vitrificación redujo significamente la calidad de los espermatozoides en comparación con las muestras frescas, la temperatura de calentamiento influyó críticamente en la recuperación postdescongelación:

• Viabilidad y Motilidad: El calentamiento a 37°C resultó en una motilidad total (40.13% frente a 24.33%) y una viabilidad (47.53% frente a 30.23%) significativamente mayores en comparación con el calentante a 42°C (p < 0.05). La motilidad progresiva fue numéricamente superior a 37°C, pero no alcanzó significancia estadística entre los dos grupos de calentamiento.
• Morfología: El porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales fue significativamente mayor en el grupo de 37°C (72.91%) en comparación con el grupo de 42°C (68.51%). Las anomalías más comunes observadas post-vitrificación fueron gotas citoplasmáticas y colas dobladas o enrolladas.
• Parámetros Cinéticos: La mayoría de los parámetros de velocidad (VCL, VSL, VAP, LIN, ALH, BCF) no mostraron diferencias significativas entre las muestras frescas y las vitrificadas, ni entre los dos regímenes de calentamiento. Sin embargo, la rectitud (STR) sí mostró variaciones significativas.
• Desempeño del Extensor: La combinación de agua de coco y yema de huevo apoyó con éxito el proceso de vitrificación, obteniendo parámetros post-calentamiento comparables o superiores a los valores reportados previamente para espermatozoides epididimales.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores concluyen que el protocolo de calentamiento es un factor decisivo en el éxito de la vitrificación de espermatozoides epididimales caninos. Específicamente, el estudio afirma que el calentamiento a 37°C durante 2 minutos proporciona una preservación superior de la función espermática (viabilidad, motilidad total y morfología normal) en comparación con el calentamiento a 42°C.

Este hallazgo contrasta con algunos datos previos sobre semen eyaculado, sugiriendo que las características biológicas únicas de los espermatozoides epididimales (como la ausencia de proteínas del plasma seminal) pueden hacerlos más sensibles a las temperaturas de calentamiento más altas. El artículo postula que la combinación de un extensor basado en agua de coco con yema de huevo, junto con un régimen de calentamiento a 37°C, representa un enfoque práctico y efectivo para el banco de germoplasma canino. El estudio enfatiza que la optimización de las condiciones de calentamiento es un componente crítico de los protocolos de vitrificación para preservar recursos genéticos valiosos, particularmente para animales donde la recuperación epididimal es la única opción para la preservación genética. Los autores señalan las limitaciones respecto al tamaño de la muestra y llaman a futuras investigaciones para evaluar los resultados de fertilidad mediante inseminación artificial y explorar aditivos crioprotectores adicionales.