Effect of Warming Regimen on Canine Epididymal Spermatozoa Following Vitrification Using a Coconut Water Extender Supplemented with Egg Yolk

Resumo Técnico: Efeito do Regime de Aquecimento em Espermatozoides Epididimais Caninos Após Vitrificação

Definição do Problema
A preservação do material genético canino via recuperação de esperma epididimal e vitrificação é cada vez mais vital para programas de reprodução e conservação de germoplasma, particularmente para animais submetidos à orquiectomia, morte inesperada ou gestão de espécies ameaçadas. Embora o congelamento lento convencional permaneça como o padrão para o sêmen canino, ele frequentemente resulta em sobrevivência pós-descongelamento variável. A vitrificação, uma técnica de solidificação ultrarrápida, oferece uma alternativa promissora, mas requer a otimização precisa do protocolo. Um fator crítico, porém pouco investigado, no sucesso da vitrificação é o procedimento de aquecimento (desvitrificação). Embora estudos anteriores tenham explorado as taxas de aquecimento para o sêmen canino ejaculado, a influência específica de diferentes temperaturas de aquecimento lento nos espermatozoides epididimais — que diferem biologicamente do esperma ejaculado em composição de membrana e pela ausência de plasma seminal — permanece incerta. Além disso, a eficácia de extensores naturais como a água de coco, combinada com gema de ovo, especificamente para a vitrificação de esperma epididimal, não foi totalmente estabelecida.

Metodologia
O estudo utilizou espermatozoides epididimais coletados de doze cães clinicamente saudáveis de várias raças submetidos a orquiectomia de rotina na Universidade de Trakia. O esperma foi recuperado através do método de flutuação (float-up) da cauda do epidídimo e do ductus deferens.

• Formulação do Extensor: As amostras foram processadas em um extensor à base de água de coco (50% de água de coco, 25% de água destilada, 25% de citrato de mono sódio anidro a 5%) suplementado com 20% de gema de ovo. A água de coco foi obtida de cocos verdes certificados orgânicos.
• Vitrificação: Após o equilíbrio a 4°C por 60 minutos, alíquotas de 33 µL foram vitrificadas por deposição direta em um coador de aço inoxidável acima de nitrogênio líquido (LN₂). As amostras foram armazenadas em LN₂ por 7 dias.
• Regimes de Aquecimento: Após o armazenamento, as amostras foram desvitrificadas utilizando dois protocolos distintos de aquecimento lento, ambos com duração de 2 minutos:
  1. 37°C: Amostras aquecidas em meio CaniPlus AI a 37°C.
  2. 42°C: Amostras aquecidas em meio CaniPlus AI a 42°C.
• Avaliação: A qualidade espermática foi avaliada antes da vitrificação e após o aquecimento usando Análise de Espermatozoides Assistida por Computador (CASA) para motilidade e parâmetros cinéticos (VCL, VSL, VAP, LIN, STR, ALH, BCF), coloração SpermBlue para morfologia e coloração eosin-nigrosina para viabilidade. A análise estatística empregou ANOVA de medidas repetidas com teste post hoc de Tukey.

Principais Resultados
O estudo demonstrou que, embora a vitrificação tenha reduzido significativamente a qualidade espermática em comparação com as amostras frescas, a temperatura de aquecimento influenciou criticamente a recuperação pós-descongelamento:

• Viabilidade e Motilidade: O aquecimento a 37°C resultou em motilidade total (40,13% vs. 24,33%) e viabilidade (47,53% vs. 30,23%) significativamente maiores em comparação ao aquecimento a 42°C (p < 0,05). A motilidade progressiva foi numericamente superior a 37°C, mas não atingiu significância estatística entre os dois grupos de aquecimento.
• Morfologia: A porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais foi significativamente maior no grupo de 37°C (72,91%) em comparação ao grupo de 42°C (68,51%). As anormalidades mais comuns observadas pós-vitrificação foram gotas citoplasmáticas e caudas dobradas ou enroladas.
• Parâmetros Cinéticos: A maioria dos parâmetros de velocidade (VCL, VSL, VAP, LIN, ALH, BCF) não mostrou diferenças significativas entre as amostras frescas e vitrificadas, nem entre os dois regimes de aquecimento. No entanto, a retidão (STR) apresentou variação significativa.
• Desempenho do Extensor: A combinação de água de coco e gema de ovo suportou com sucesso o processo de vitrificação, produzindo parâmetros pós-aquecimento comparáveis ou superiores aos valores relatados anteriormente para esperma epididimal.

Significância e Alegações
Os autores concluem que o protocolo de aquecimento é um fator decisivo no sucesso da vitrificação de espermatozoides epididimais caninos. Especificamente, o estudo afirma que o aquecimento a 37°C por 2 minutos proporciona uma preservação superior da função espermática (viabilidade, motilidade total e morfologia normal) em comparação ao aquecimento a 42°C.

Este achado contrasta com dados anteriores sobre sêmen ejaculado, sugerindo que as características biológicas únicas do esperma epididimal (como a ausência de proteínas do plasma seminal) podem torná-los mais sensíveis a temperaturas de aquecimento mais elevadas. O artigo postula que a combinação de um extensor à base de água de coco com gema de ovo, juntamente com um regime de aquecimento a 37°C, representa uma abordagem prática e eficaz para o banco de germoplasma canino. O estudo enfatiza que a otimização das condições de aquecimento é um componente crítico dos protocolos de vitrificação para a preservação de recursos genéticos valiosos, particularmente para animais onde a recuperação epididimal é a única opção para preservação genética. Os autores observam limitações quanto ao tamanho da amostra e convocam pesquisas futuras para avaliar os resultados de fertilidade via inseminação artificial e para explorar aditivos crioprotetores adicionais.