Effect of Warming Regimen on Canine Epididymal Spermatozoa Following Vitrification Using a Coconut Water Extender Supplemented with Egg Yolk

Technische Samenvatting: Effect van het opwarmregime op caniele epididymale spermatozoa na vitrificatie

Probleemstelling
De preservatie van caniele genetisch materiaal via epididymale sperma-extractie en vitrificatie wordt steeds belangrijker voor fokprogramma's en de conservering van kiemplasma, met name voor dieren die een orchiectomie ondergaan, onverwacht overlijden of bij beheer van bedreigde diersoorten. Hoewel conventionele langzame invriezing de standaard blijft voor caniele semen, levert dit vaak variabele overleving na ontdooiing op. Vitrificatie, een ultra-snelle solidificatietechniek, biedt een veelbelovend alternatief, maar vereist nauwkeurige protocoloptimalisatie. Een cruciale, maar nog onvoldoende onderzochte factor in het succes van vitrificatie is het opwarmproces (devitrificatie). Hoewel eerdere studies de opwarmsnelheden voor geëjaculeerd caniel sperma hebben onderzocht, blijft de specifieke invloed van verschillende langzame opwarmtemperaturen op epididymale spermatozoa — die biologisch verschillen van geëjaculeerd sperma vanwege de membraansamenstelling en het ontbreken van seminaal plasma — onduidelijk. Bovendien is de effectiviteit van natuurlijke extensoren zoals kokoswater, in combinatie met eigeel, specifiek voor de vitrificatie van epididymale sperma, nog niet volledig vastgesteld.

Methodologie
De studie maakte gebruik van epididymale spermatozoa verzameld van twaalf klinisch gezonde honden van diverse rassen die een routineuze orchiectomie ondergingen aan de Trakia Universiteit. Sperma werd verkregen via de float-up methode uit de cauda epididymis en de ductus deferens.

• Extender-formulering: De monsters werden verwerkt in een extender op basis van kokoswater (50% kokoswater, 25% gedestilleerd water, 25% 5% water vrij anidrisch mononatriumcitraat), aangevuld met 20% eigeel. Het kokoswater werd afkomstig van gecertificeerde biologische groene kokosnoten.
• Vitrificatie: Na equilibratie bij 4°C gedurende 60 minuten, werden aliquotten van 33 µL gevitrificeerd door directe druppelvorming op een roestvrijstalen zeef boven vloeibaar stikstof (LN₂). De monsters werden gedurende 7 dagen in LN₂ bewaard.
• Opwarmregimes: Na opslag werden de monsters gedevitrificeerd met behulp van twee verschillende langzame opwarmprotocollen, beide met een duur van 2 minuten:
  1. 37°C: Monsters werden opgewarmd in CaniPlus AI medium bij 37°C.
  2. 42°C: Monsters werden opgewarmd in CaniPlus AI medium bij 42°C.
• Evaluatie: De spermakwaliteit werd beoordeeld vóór vitrificatie en na opwarming met behulp van Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA) voor motiliteit en kinetische parameters (VCL, VSL, VAP, LIN, STR, ALH, BCF), SpermBlue kleuring voor morfologie, en eosin-nigrosine kleuring voor vitaliteit. Statistische analyse werd uitgevoerd met repeated-measures ANOVA met de Tukey's post hoc test.

Belangrijkste Resultaten
De studie toonde aan dat hoewel vitrificatie de spermakwaliteit significant verminderde in vergelijking met verse monsters, de opwarmtemperatuur de post-thaw recovery cruciaal beïnvloedde:

• Vitaliteit en Motiliteit: Opwarmen bij 37°C resulteerde in een significant hogere totale motiliteit (40,13% vs. 24,33%) en vitaliteit (47,53% vs. 30,23%) vergeleken met opwarmen bij 42°C (p < 0,05). Progressieve motiliteit was numeriek hoger bij 37°C, maar bereikte geen statistische significantie tussen de twee opwarmgroepen.
• Morfologie: Het percentage morfologisch normale spermatozoa was significant hoger in de 37°C groep (72,91%) vergeleken met de 42°C groep (68,51%). De meest voorkomende abnormaliteiten waargenomen na vitrificatie waren cytoplasmatische druppels en gebogen of gekrulde staarten.
• Kinetische Parameters: De meeste snelheidsparameters (VCL, VSL, VAP, LIN, ALH, BCF) vertoonden geen significante verschillen tussen verse en gevitrificeerde monsters, noch tussen de twee opwarmregimes. Echter, de rechtvormigheid (STR) vertoonde wel significante variatie.
• Prestaties van de Extender: De combinatie van kokoswater en eigeel ondersteunde het vitrificatieproces succesvol, waarbij post-opwarmingsparameters werden opgeleverd die vergelijkbaar zijn met of de eerder gerapporteerde waarden voor epididymale sperma overtreffen.

Betekenis en Claims
De auteurs concluderen dat het opwarmprotocol een beslissende factor is in het succes van het vitrificeren van caniele epididymale spermatozoa. Specifiek claimt de studie dat opwarmen bij 37°C gedurende 2 minuten zorgt voor een superieure preservatie van de spermafunctie (vitaliteit, totale motiliteit en normale morfologie) vergeleken met opwarmen bij 42°C.

Deze bevinding staat in contrast met sommige eerdere gegevens over geëjaculeerd sperma, wat suggereert dat de unieke biologische kenmerken van epididymale sperma (zoals de afwezigheid van seminaal plasma-eiwitten) hen gevoeliger kunnen maken voor hogere opwarmtemperaturen. Het artikel stelt dat de combinatie van een extender op basis van kokoswater met eigeel, samen met een 37°C opwarmregime, een praktische en effectieve aanpak vormt voor het bankeren van caniele kiemplasma. De studie benadrukt dat het optimaliseren van de opwarmcondities een kritiek onderdeel is van vitrificatieprotocollen voor de preservatie van waardevolle genetische bronnen, met name voor dieren waarbij epididymale extractie de enige optie is voor genetische preservatie. De auteurs merken beperkingen op wat betreft de steekproefomvang en roepen op tot toekomstig onderzoek om vruchtbaarheidscijfers via kunstmatige inseminatie te evalueren en om aanvullende cryoprotectieve additieven te verkennen.