Granzyme A amplifies human neutrophil pyroptosis

Resumen Técnico: La Granzima A amplifica la piroptosis en neutrófilos humanos

Planteamiento del problema
Los neutrófilos son reguladores críticos de la inmunidad innata y su vida útil está estrictamente controlada para prevenir la inflamación crónica o la autoinmunidad. Si bien las serina proteasas de los gránulos de los neutrófilos (NSP), como la elastasa de neutrófilos (NE) y la catepsina G (CatG), son conocidas por regular la muerte celular, el papel de la Granzima A (GrA) en los neutrófilos sigue siendo controvertido. La literatura previa ha debatido si los neutrófilos humanos siquiera expresan GrA y, si la expresan, si se localiza en los gránulos primarios (azurófilos) o secundarios. Además, el mecanismo por el cual la GrA podría influir en los programas de muerte celular regulada, específicamente en la piroptosis, no estaba definido. A diferencia de los linfocitos citotóxicos donde la GrA impulsa la muerte independiente de caspasas, su contribución a las vías de muerte de los neutrófilos y su relación con la formación de poros mediada por gasdermina permanecían desconocidas.

Metodología
El estudio empleó un enfoque de múltiples modelos combinando neutrófilos humanos primarios, neutrófilos murinos (de ratones silvestres y deficientes en GrA) y neutrófilos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSneu).

• Inhibición farmacológica: Se utilizó el inhibidor selectivo y covalente de GrA, iSK15, para evaluar la función de la GrA en la muerte celular inducida por nigericina (un activador del inflamasoma) y LLME (un agente lisosomotrópico).
• Modelos genéticos: Se utilizaron ratones deficientes en GrA (GrA−/−) para validar los hallazgos genéticamente, aunque se observaron diferencias específicas de especie.
• Ensayos bioquímicos:
  • Localización: Se utilizaron la inmunofluorescencia dual y el análisis de colocalización cuantitativa (correlación de Pearson) para mapear la GrA frente a marcadores de gránulos primarios (NE, PR3) y marcadores secundarios/terciarios (lactoferrina, MMP9).
  • Actividad: Las sondas de actividad basada en actividad (SK15.5) y los inhibidores covalentes (iSK15) confirmaron la presencia de GrA catalíticamente activa en los lisados.
  • Análisis de escisión: La GrA humana recombinante se expresó en Komagataella phaffi y se probó contra GSDMD, GSDME, GSDMB y NINJ1 sobreexpresados. Se sintetizaron bibliotecas de péptidos de fluorescencia interna amortiguada (IQF) para mapear sitios de escisión de arginina específicos.
  • Monitoreo de la muerte celular: Se utilizaron imágenes de confocal en células vivas (SYTOX Green para integridad de membrana, CellROX para ROS) y citometría de flujo para rastrear la piroptosis, la apoptosis y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) a lo largo del tiempo.
• Controles: Los inhibidores pan-caspasas (QVD-OPh) y los inhibidores de caspasas específicos (DEVD-FMK, YVAD-CMK) se utilizaron para distinguir entre vías dependientes e independientes de caspasas.

Resultados clave

1. Expresión y localización: La GrA se expresa constitutivamente en los neutrófilos humanos y reside principalmente en los gránulos primarios (azurófilos), colocalizando con NE y PR3, en lugar de en los gránulos secundarios. Crucialmente, la GrA se almacena en una forma catalíticamente activa dentro de estos gránulos.
2. Papel en la piroptosis: La inhibición farmacológica de la GrA con iSK15 retrasó y atenuó significativamente la piroptosis inducida por nigericina en neutrófilos humanos. Esta inhibición fue más efectiva que la inhibición de pan-caspasas, lo que sugiere un mecanismo de amplificación dependiente de caspasas aguas abajo de la activación del inflamasoma.
3. Especificidad de especie: A diferencia de los neutrófilos humanos, los neutrófilos de ratón mostraron una expresión y actividad de GrA insignificantes. En consecuencia, los neutrófilos de ratones deficientes en GrA no difirieron de los controles silvestres tras la estimulación con nigericina, lo que resalta una divergencia de estructura y función específica de la especie.
4. Mecanismo de acción:
   • Interacción con la gasdermina: La GrA escinde directamente GSDMD y GSDME. Sin embargo, a diferencia de la escisión canónica por caspasas en residuos de aspartato, la GrA escinde estas proteínas en residuos de Arginina (por ejemplo, GSDMD en Arg465, Arg267, Arg151; GSDME en Arg119).
   • Fragmentación vs. Activación: Los patrones de escisión generados por la GrA no produjeron fragmentos de formación de poros N-terminales estables y canónicos. Sin embargo, los datos sugieren que, si bien la GrA generalmente potencia la piroptosis a través de vías independientes de gasdermina, la escisión en el sitio R267 del conector interdominio de GSDMD puede activar a GSDMD mediante un mecanismo de procesamiento no canónico.
   • Generación de ROS: La inhibición de la GrA redujo la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la piroptosis, vinculando a la GrA con la perturbación mitocondrial y el estrés oxidativo, de manera similar a su papel en los linfocitos citotóxicos.
5. Dinámica temporal: Durante la piroptosis, la GrA activa permanece predominantemente intracelular y se traslada de los gránulos al citosol en etapas tempranas del proceso. Solo se libera extracelularmente en etapas tardías, coincidiendo con la lisis celular terminal.
6. Apoptosis vs. Piroptosis: La inhibición de la GrA no afectó la apoptosis espontánea de los neutrófilos, confirmando su papel específico en los programas de muerte celular lítica.

Significancia y afirmaciones
El artículo identifica a la Granzima A como un regulador no canónico de la piroptosis de los neutrófilos. Los autores afirman que la GrA actúa como un amplificador intracelular de la muerte en los neutrófilos humanos, funcionando aguas abajo de la activación del inflamasoma pero en gran medida de forma independiente de las caspasas.

• El estudio resuelve la controversia sobre la expresión de la GrA, confirmando su presencia en los gránulos primarios en un estado activo.
• Propone un modelo donde la permeabilización de los gránulos expone la GrA activa a los sustratos citosólicos, acelerando el daño a la membrana y la generación de ROS.
• Los autores sugieren que la escisión de las gasderminas por la GrA puede representar un evento regulatorio o de inactivación, o en el caso específico del sitio R267, una activación no canónica, distinguiendo su mecanismo de otras proteasas.
• Finalmente, el artículo respalda el potencial de la inhibición selectiva de la GrA como una estrategia terapéutica tratable para modular las respuestas inflamatorias impulsadas por neutrófilos, particularmente en contextos humanos donde la GrA desempeña un papel funcional.

Los autores mantienen la modestia respecto al resultado molecular exacto de la escisión de la gasdermina por la GrA, señalando que se requiere una caracterización funcional adicional de los fragmentos resultantes para comprender plenamente su contribución al fenotipo de muerte. Enfatizan que la GrA actúa como un modulador de la tasa y la eficiencia de la ejecución de la muerte en lugar de un ejecutor indispensable, debido probablemente a la redundancia con otras proteasas granulares.