Standardised parts and vectors for Golden Gate assembly of DNA for mammalian expression

En el vasto paisaje de la biología moderna, los investigadores a menudo necesitan construir máquinas genéticas personalizadas para estudiar cómo funcionan las células o para desarrollar nuevos medicamentos. Estas máquinas no están hechas de metal o plástico, sino de ADN, el manual de instrucciones que se encuentra dentro de cada ser vivo. Para crear una instrucción genética específica, los científicos deben ensamblar diferentes piezas de código, de forma muy similar a como un carpintero une tablas para construir una mesa. Durante décadas, este proceso fue lento y difícil, requiriendo que los científicos utilizaran una variedad de herramientas y métodos especializados que no siempre encajaban entre sí. Un método poderoso, conocido como ensamblaje Golden Gate, permite a los investigadores unir piezas de ADN rápidamente utilizando enzimas específicas que actúan como tijeras y pegamento moleculares. Sin embargo, para que este método funcione sin problemas, cada pieza de ADN debe ser cortada y moldeada de una manera precisa y estandarizada. Sin un conjunto común de piezas que todos acepten utilizar, los científicos se ven obligados a reinventar la rueda en cada nuevo proyecto, lo que ralentiza el progreso en campos que van desde la investigación básica hasta el desarrollo de terapias génicas.

Un equipo de investigadores del Instituto de Química Bioorgánica y del Consejo de Investigación Médica ha abordado este cuello de botella mediante la creación de un conjunto de herramientas completo y estandarizado para construir instrucciones genéticas para células de mamíferos. Las células de mamíferos, que incluyen las células humanas, son particularmente valiosas para la investigación porque pueden plegar proteínas y modificarlas de formas que las bacterias no pueden, lo que las hace esenciales para la creación de medicamentos que funcionen en el cuerpo humano. El equipo, liderado por Nikita Strokach y sus colegas, diseñó y ensambló una biblioteca de 131 componentes genéticos distintos, todos optimizados para trabajar juntos bajo un sistema único y unificado. Esta colección incluye los interruptores que encienden y apagan los genes, las señales que indican a las proteínas hacia dónde ir dentro de una célula y los marcadores fluorescentes que permiten a los científicos ver si su construcción genética está funcionando. Al organizar estas piezas en ocho categorías claras, los investigadores han hecho posible el ensamblaje de circuitos genéticos complejos en un solo paso, en lugar de pasar semanas o meses en el proceso de ensamblaje.

El poder de este nuevo conjunto de herramientas reside en su versatilidad y en su capacidad para entregar instrucciones genéticas en las células utilizando tres métodos diferentes. Los investigadores probaron sus piezas construyendo varios constructos genéticos y enviándolos a células humanas utilizando tres vehículos de entrega distintos: un virus inofensivo llamado virus adenoasociado, un sistema de genes saltarines conocido como PiggyBac, y un lentivirus. En cada caso, insertaron un gen que produce una proteína brillante, actuando como una señal visual de que el ensamblaje genético fue exitoso. Cuando utilizaron el virus adenoasociado para entregar las instrucciones, casi todas las células del grupo de prueba comenzaron a brillar, mostrando que el sistema podía entrar eficientemente en las células y empezar a trabajar. Del mismo modo, cuando utilizaron el sistema PiggyBac, la proteína brillante no solo estaba presente, sino que se integró permanentemente en el propio ADN de la célula, permitiendo que las células transmitieran las nuevas instrucciones a sus descendientes a medida que se dividían. Las pruebas con lentivirus mostraron los mismos resultados robustos, con células que brillaban intensamente y mantenían ese brillo durante múltiples generaciones.

Lo que hace que este trabajo sea particularmente significativo es que no solo funciona en un escenario específico; funciona a través de diferentes métodos de entrega y para diferentes tipos de tareas genéticas. Los investigadores confirmaron que sus piezas estandarizadas funcionan correctamente, ya sea que el objetivo sea un experimento temporal donde el material genético permanezca en la célula por un corto tiempo, o un cambio permanente donde el nuevo ADN se convierta en una parte fija del genoma de la célula. Validaron que los marcadores fluorescentes que incluyeron eran lo suficientemente brillantes como para verse claramente bajo un microscopio, y que las células se mantuvieron sanas y estables durante todo el proceso. Este nivel de consistencia es crucial porque significa que un científico puede diseñar un circuito genético una vez y confiar en que funcionará, ya sea que lo esté utilizando para estudiar una proteína específica, para silenciar un gen dañino o para manipular una célula para combatir una enfermedad.

El conjunto de herramientas incluye una amplia gama de componentes funcionales, tales como promotores que actúan como interruptores de encendido para los genes, conectores que unen diferentes partes de un circuito genético y etiquetas que permiten a los científicos rastrear proteínas específicas. También contiene piezas para herramientas de edición genética avanzada, incluyendo versiones de la proteína Cas utilizada en la tecnología CRISPR, que permite el corte preciso del ADN. Al proporcionar estos elementos en un formato preoptimizado y listo para usar, los investigadores han eliminado la necesidad de que otros científicos dediquen tiempo a optimizar cada pieza para las células de mamíferos. El equipo señaló que, aunque existen otros conjuntos de herramientas, muchos utilizan reglas diferentes o carecen de la diversidad de piezas necesarias para la ingeniería compleja de mamíferos. Esta nueva colección llena ese vacío, ofreciendo un conjunto de piezas universales que sigue el estándar MoClo, ampliamente aceptado, asegurando que las piezas encajen perfectamente.

El éxito de este proyecto se demostró mediante rigurosas pruebas en el laboratorio. Los investigadores cultivaron células humanas en condiciones controladas, introduciendo cuidadosamente los constructos genéticos y observando los resultados a lo largo del tiempo. Descubrieron que las células expresaban las proteínas deseadas con alta eficiencia y que los cambios genéticos eran estables, persistiendo a través de muchas divisiones celulares. Esta estabilidad es un indicador clave de que las instrucciones genéticas se integraron con éxito en el genoma de la célula, un requisito para muchas aplicaciones terapéuticas a largo plazo. El equipo también confirmó que las piezas que diseñaron eran compatibles con sistemas existentes, lo que significa que los científicos que ya utilizan métodos similares pueden adoptar fácilmente estas nuevas piezas sin tener que reformar todo su flujo de trabajo.

Este trabajo representa un paso práctico hacia adelante en el campo de la ingeniería genética, alejándose de soluciones fragmentadas y específicas de cada proyecto hacia una infraestructura compartida y estandarizada. Al proporcionar una biblioteca amplia y verificada de piezas que funcionan de manera fiable a través de diferentes métodos de entrega, los investigadores han reducido la barrera de entrada para experimentos genéticos complejos. El resultado es un sistema que permite a los científicos centrarse en las preguntas biológicas que quieren responder, en lugar de en los obstáculos técnicos de construir las propias herramientas genéticas. A medida que el conjunto de herramientas esté disponible para la comunidad científica en general, promete acelerar el ritmo de los descubrimientos en la investigación de células de mamíferos, permitiendo un desarrollo más rápido de nuevas terapias y una comprensión más profunda de cómo funcionan las células humanas. Los investigadores han puesto sus plásmidos a disposición para uso no comercial, asegurando que este recurso pueda compartirse ampliamente para apoyar la próxima generación de avances en ingeniería genética.