Standardised parts and vectors for Golden Gate assembly of DNA for mammalian expression

現代の生物学という広大な風景の中で、研究者たちは細胞がどのように機能するかを研究したり、新しい薬を開発したりするために、カスタムの遺伝子マシンを構築する必要があることがよくあります。これらのマシンは金属やプラスチックで作られるのではなく、あらゆる生物の中に存在する設計図であるDNAで作られます。特定の遺伝的指示を作成するために、科学者は、大工が板を組み合わせてテーブルを作るように、異なるコードの断片を組み立てなければなりません。数十年にわたり、このプロセスは遅く困難なものであり、科学者は必ずしも互いに適合しない様々な専門的なツールや手法を使用する必要がありました。ゴールデンゲート・アセンブリーとして知られる強力な手法の一つは、分子のハサミと糊として機能する特定の酵素を使用して、DNAの断片を素早く結合させることを可能にします。しかし、この手法をスムーズに機能させるためには、すべてのDNA断片が精密かつ標準化された方法で切断され、成形されていなければなりません。誰もが使用することに同意する共通のパーツがなければ、科学者は新しいプロジェクトごとに車輪の再発明を強いられ、基礎研究から遺伝子治療の開発に至るまでの分野の進歩を遅らせることになります。

Institute of Bioorganic Chemistry（生体有機化学研究所）とMedical Research Council（医学研究評議会）の研究チームは、哺乳類細胞のための遺伝的指示を構築するための包括的で標準化されたツールキットを作成することで、このボトルネックに対処しました。ヒト細胞を含む哺乳類細胞は、細菌にはできない方法でタンパク質を折り畳んだり修飾したりできるため、研究において特に価値が高く、ヒトの体内で機能する薬を作成するために不可ло欠です。ニキータ・ストロカッチ氏率いるチームは、単一の統一されたシステムの下で共に機能するように最適化された、131種類の異なる遺伝子コンポーネントからなるライブラリを設計し、組み立てました。このコレクションには、遺伝子のオン・オフを切り替えるスイッチ、タンパク質が細胞内のどこへ行くべきかを指示する信号、そして遺伝的構築物が機能しているかどうかを科学者が確認できるようにするための蛍光マーカーが含まれています。これらのパーツを8つの明確なカテゴリーに整理することで、研究者たちは複雑な遺伝回路を数週間や数ヶ月の組み立てプロセスに費やすことなく、単一のステップで組み立てることを可能にしました。

この新しいツールキットの力は、その汎用性と、3つの異なる方法で細胞に遺伝的指示を送り込む能力にあります。研究者たちは、いくつかの遺伝的構築物を構築し、3つの異なるデリバリー車両を用いてそれらをヒト細胞に送り込むことで、自分たちのパーツをテストしました。デリバリー車両には、アデノ随伴ウイルスと呼ばれる無害なウイルス、PiggyBacと呼ばれる跳躍遺伝子システム、そしてレンチウイルスが含まれます。それぞれの場合において、彼らは光るタンパク質を生成する遺伝子を挿入し、遺伝的組み立てが成功したことを示す視覚的な信号として機能させました。アデノ随伴ウイルスを使用して指示を届けたとき、テストグループのほぼすべての細胞が光り始め、システムが効率的に細胞内に侵入して機能を開始できることを示しました。同様に、PiggyBacシステムを使用したとき、光るタンパク質は存在するだけでなく、細胞自身のDNAに永久に組み込まれており、細胞が分裂する際に新しい指示をその子供たちに受け継ぐことができるようにしました。レンチウイルスのテストでも同様の堅牢な結果が得られ、細胞は明るく輝き、複数の世代にわたってその輝きを維持しました。

この研究が特に重要である理由は、それが単一の特定的なシナリオで機能するだけでなく、異なるデリバリー方法や異なる種類の遺伝的タスクにわたって機能することにあります。研究者たちは、彼らの標準化されたパーツが、遺伝物質が細胞内に短期間留まる一時的な実験を目的としているのか、あるいは新しいDNAが細胞のゲノムの一部として固定される永久的な変化を目的としているのかに関わらず、正しく機能することを確認しました。彼らは、含まれている蛍光マーカーが顕微鏡下で明確に見えるほど十分に明るいこと、そしてプロセス全体を通じて細胞が健康で安定していることを検証しました。このレベルの一貫性は非常に重要です。なぜなら、科学者が一度遺伝回路を設計すれば、特定のタンパク質を研究するためであれ、有害な遺伝子を抑制するためであれ、あるいは疾患と戦うために細胞をエンジニアリングするためであれ、それがどのように使用されるかにかかわらず、確実に機能することを信頼できることを意味するからです。

このツールキットには、遺伝回路の異なる部分を接続するリンカーや、遺伝子のオン・スイッチとして機能するプロモーター、そして科学者が特定のタンパク質を追跡することを可能にするタグなど、幅広い機能的コンポーネントが含まれています。また、DNAの精密な切断を可能にするCRISPR技術で使用されるCasタンパク質のバージョンを含む、高度な遺伝子編集ツールのためのパーツも含まれています。これらの要素を、事前に最適化され、すぐに使用できる形式で提供することにより、研究者たちは他の科学者が哺乳類細胞向けに各パーツを最適化するために費やす必要性を排除しました。チームは、他のツールキットも存在するものの、多くは異なるルールを使用しているか、複雑な哺乳類エンジニアリングに必要なパーツの多様性に欠けていると指摘しています。この新しいコレクションはそのギャップを埋めるものであり、広く受け入れられているMoClo標準に従い、パーツがシームレスに適合することを保証するユニバーサルなパーツセットを提供しています。

このプロジェクトの成功は、ラボでの厳格なテストを通じて実証されました。研究者たちは制御された条件下でヒト細胞を培養し、遺伝的構築物を慎重に導入して、その結果を観察しました。彼らは、細胞が意図したタンパク質を高効率で発現していること、および遺伝的変化が安定しており、多くの細胞分裂を通じて持続していることを見出しました。この安定性は、遺伝的指示が細胞のゲノムに正常に統合されたことを示す重要な指標であり、多くの長期的な治療応用における要件です。チームはまた、設計したパーツが既存のシステムとも互換性があることを確認しました。これは、科学者がすでに同様の手法を使用している場合、ワークフロー全体を刷新することなく、これらの新しいパーツを容易に採用できることを意味します。

この研究は、断片化されたプロジェクト固有のソリューションから、共有された標準化されたインフラストラクチャへと、遺伝子工学の分野における実用的な前進を象徴しています。異なるデリバリー方法にわたって信頼性高く機能する、検証済みの大規模なパーツライブラリを提供することで、研究者たちは複雑な遺伝子実験への参入障壁を下げました。その結果、科学者は遺伝的ツール自体を構築するという技術的なハードルではなく、解決したい生物学的な問いに集中できるシステムを実現しました。このツールキットがより広い科学コミュニックティに提供されるにつれ、哺乳類細胞研究の発見のペースを加速させ、新しい治療法の迅速な開発と、ヒト細胞がどのように機能するかについてのより深い理解を可能にすることが期待されます。研究者たちは、このリソースが次世代の遺伝子工学のブレークスルーを支援するために広く共有されるよう、彼らのプラスミドを非商業的な用途で公開しています。