Fungi synthesize flavonoids, but not isoflavones - a risk of feeding source contamination

Résumé technique : Biosynthèse des flavonoïdes fongiques et risque de contamination des milieux

Énoncé du problème
Bien que les flavonoïdes soient largement reconnus comme des polyphénols végétaux, de nombreuses études au cours des deux dernières décennies ont rapporté leur production par des champignons, y compris des champignons comestibles issus d'Ascomycota et de Basidiomycota. Cependant, la validité de ces rapports reste controversée. Une revue critique de Pukalski et Latowski a souligné l'absence de preuves définitives, suggérant que de nombreuses détections rapportées pourraient être des artefacts résultant de l'utilisation de substrats de croissance complexes dérivés de plantes. Plus précisément, l'affirmation selon laquelle les champignons produisent des flavonoïdes structurellement avancés, en particulier des isoflavones, manque de confirmation moléculaire. Cette étude aborde l'incertitude concernant la biosynthèse des flavonoïdes par les champignons en étudiant le potentiel de contamination par des dérivés végétaux dans les milieux de culture et en menant un inventaire génomique complet des voies de biosynthèse des flavonoïdes à travers les lignées fongiques.

Méthodologie
La recherche a employé une double approche combinant analyse chimique et bioinformatique :

1. Analyse chimique des milieux et des métabolites :

   • Dépistage : Treize composants de milieux microbiens couramment utilisés ont été testés pour la présence d'isoflavones.
   • Extraction et identification : Les milieux de culture (spécifiquement la base de bouillon d'extrait de malt) et les métabolites secondaires fongiques ont été extraits à l'aide de solvants organiques. Les composés ont été analysés par HPLC/UV-VIS, spectrométrie de masse à haute résolution avec ionisation par électrospray (HRESIMS) et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN).
   • Validation : Les structures ont été confirmées par comparaison des données expérimentales RMN et HPLC avec des étalons commerciaux, appuyées par des calculs de la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT).
   • Test de stabilité : Des souches d'Exobasidium ont été cultivées dans des milieux contenant des isoflavones pendant 14 jours pour déterminer si les champignons métabolisent ou dégradent ces composés.

2. Inventaire génomique bioinformatique :

   • Base de données : Un inventaire a été réalisé sur plus de 5 700 génomes fongiques annotés dans la base de données NCBI.
   • Enzymes cibles : Des recherches d'homologie (BLASTP) ont été effectuées contre des séquences de référence végétales pour les enzymes clés des voies de la phénylpropanoïde et des flavonoïdes : phénylalanine ammonia-lyase (PAL), trans-cinnamate 4-monooxygénase (C4H), 4-coumarate-CoA ligase (4CL), chalcone synthase (CHS), chalcone isomérase (CHI), 2-hydroxyisoflavanone synthase (IFS) et 2-hydroxyisoflavanone déhydratase (HID).
   • Spécificités fongiques : L'étude a également recherché des enzymes connues spécifiques aux champignons, notamment les hybrides NRPS-PKS cfoA (Aspergillus), fnsA (Pestalotiopsis), ainsi que leurs gènes associés cfoK (CHI) et cfoJ (FNS).
   • Critères : Les homologues ont été filtrés en utilisant des seuils stricts (>30 % d'identité, E-value <0,001, >70 % de couverture de la requête).

Résultats clés

• Présence d'isoflavones dans les milieux : Une concentration substantielle d'isoflavones dérivées de plantes a été détectée dans la base de bouillon d'extrait de malt (HiMedia), spécifiquement dans le composant « peptone mycologique » (un mélange de 30 % de plantes et 70 % d'animaux). Les composés identifiés sont la daidzéine (21,49 µg/g), la glycitéine (0,41 µg/g), la génistéine (15,95 µg/g) et la génistine (30,89 µg/g).
• Absence de métabolisme fongique : Lors des expériences de culture avec des espèces d'Exobasidium, la concentration de ces isoflavones est restée stable pendant 14 jours, indiquant une absence de captation ou de dégradation par les champignons. Cela confirme que les isoflavones détectées dans de telles cultures proviennent du substrat et non de la synthèse fongique.
• Distribution génomique des enzymes de la voie :
  • Enzymes en amont : Les homologues des enzymes précoces de la voie de la phénylpropanoïde (PAL, C4H, 4CL) sont largement répandus dans le règne des Fungi, ce qui est cohérent avec d'anciens événements de transfert horizontal de gènes de bactéries ou de champignons vers les plantes.
  • Enzymes en aval : Crucialement, aucun génome fongique ne code pour les enzymes de type végétal canoniques nécessaires à la conversion des chalcones en flavanones ou isoflavones (CHI, IFS, HID).
  • CHS de type végétal : Bien que quelques correspondances pour la chalcone synthase (CHS) de type végétal aient été trouvées chez les Pezizomycotina et les Agaricomycotina, elles étaient marginales (proches du seuil de 30 % d'identité) et ne pouvaient être annotées avec certitude comme une CHS fonctionnelle.
  • Voies spécifiques aux champignons : La production réelle de flavones par les champignons est restreinte à des lignées spécifiques au sein des Pezizomycotina (Ascomycota). Ces champignons utilisent des hybrides NRPS-PKS ayant évolué indépendamment (par exemple, cfoA chez Aspergillus, fnsA chez Pestalotiopsis) plutôt que la voie de type CHS des plantes. Ces gènes ont été trouvés exclusivement dans des ordres spécifiques tels que les Amphisphaeriales, les Xylariales et les Hypocreales.

Contributions clés

1. Identification d'une source majeure d'artéfact : L'étude identifie de manière définitive la peptone mycologique dans les milieux de culture standards comme une source significative d'isoflavones, fournissant une explication directe aux rapports précédents de production d'isoflavones par les champignons.
2. Clarification génomique : Elle établit que la voie de biosynthèse des flavonoïdes de type végétal canonique (spécifiquement les étapes menant aux isoflavones) est absente des génomes fongiques.
3. Différenciation des voies : L'article clarifie que si les champignons peuvent produire des flavonoïdes simples (comme la chlorflavonine et la naringénine), ils le font via des mécanismes d'évolution convergente distincts (hybrides NRPS-PKS) confinés à des lignées spécifiques d'Ascomycota, plutôt que par la voie de type végétal présente chez les Basidiomycota.

Signification et affirmations
Les auteurs concluent que les rapports de flavonoïdes avancés, en particulier les isoflavones, chez les Basidiomycota (champignons) représentent probablement des artéfacts causés par la contamination des substrats dérivés de plantes plutôt que par une véritable biosynthèse fongique. L'étude affirme que les champignons peuvent produire des flavonoïdes, mais la capacité spécifique à synthétiser des isoflavones via la voie de type végétal n'est pas soutenue par les preuves génomiques.

L'article recommande que les futures études examinant les flavonoïdes fongiques utilisent des composants de milieux exempts de peptones dérivées de plantes (par exemple, de l'extrait de malt pur ou des peptones d'origine animale) afin d'éviter les faux positifs. Il souligne que la présence d'enzymes de la phénylpropanoïde en amont chez les champignons n'implique pas la capacité de réaliser une biosynthèse complète des flavonoïdes, car les enzymes critiques en aval sont absentes. Ce travail sert de correction prudente au domaine, appelant à une réévaluation de la littérature antérieure sur les métabolites secondaires fongiques à la lumière des risques de contamination des milieux.