ALPK2 promotes cell growth via the AP-1 axis in YAP/TAZ-activated oral squamous cell carcinoma

Résumé technique : ALPK2 favorise la croissance cellulaire via l'axe AP-1 dans le carcinome épidermoïde oral activé par YAP/TAZ

Énoncé du problème
Le carcinome épidermoïde buccal (CEB) demeure un défi clinique majeur, les cas avancés ou métastatiques étant associés à un mauvais pronostic. La voie de signalisation Hippo, et plus précisément l'activation aberrante de ses effecteurs YAP et TAZ, est un moteur connu de la prolifération et de la progression du CEB. Bien que les mécanismes en amont activant YAP/TAZ (tels que l'amplification d'EGFR ou la perte de FAT1) soient partiellement compris, l'ensemble des programmes transcriptionnels régulés en aval par YAP/TAZ dans le CEB reste largement méconnu. De plus, le ciblage thérapeutique direct de YAP/TAZ est difficile en raison de leur nature de co-activateurs transcriptionnels dépourvus de sites catalytiques, et les kinases en amont (MST1/2, LATS1/2) fonctionnent comme des suppresseurs de tumeurs, rendant leur inhibition contre-productive. Par conséquent, il est urgent d'identifier de nouveaux médiateurs de signalisation en aval, druggables, de l'activation de YAP/TAZ, qui pourraient servir de cibles thérapeutiques.

Méthodologie
L'étude a employé une approche multidimensionnelle pour identifier et valider les gènes de prolifération régulés par YAP/TAZ ainsi que leurs mécanismes de signalisation en aval :

• Criblage génomique : Le séquençage de l'ARN (RNA-seq) a été réalisé sur des cellules CAL27 avec KO (knockout) de LATS1/2 (qui présentent une activation constitutive de YAP/TAZ) par rapport à des contrôles de type sauvage (WT) afin d'identifier les kinases surexprimées.
• Analyse bioinformatique : Une analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA) a été effectuée en utilisant les données de la Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) et de The Cancer Genome Atlas (TCGA) pour corréler l'expression d'ALPK2 avec les signatures d'activité de YAP/TAZ à travers diverses lignées cellulaires cancéreuses et tissus.
• Validation fonctionnelle : La prolifération cellulaire a été évaluée via la coloration au cristal violet et des essais de viabilité CellTiter-Blue dans des lignées cellulaires de CEB (WSU-HN6, CAL27) et des lignées d'adénocarcinome pulmonaire mutées pour l'EGFR (HCC827, PC-9) après l'extinction (knockdown, KD) d'ALPK2 par siRNA ou shRNA.
• Élucidation mécanistique :
  • Phosphoprotéomique : L'analyse de la phosphoprotéomique quantitative sans marquage (LC-MS/MS) a été utilisée pour identifier les changements de phosphorylation protéique lors de la KD d'ALPK2.
  • Transcriptomique : Le RNA-seq et la GSEA ont été utilisés pour cartographier les changements d'expression génique en aval, en se concentrant spécifiquement sur les membres de la famille AP-1.
  • Western Blotting : Les niveaux de protéines et les états de phosphorylation de molécules clés de signalisation (ALPK2, MTA2, YB-1, FOSL1, ERK) ont été vérifiés dans plusieurs lignées cellulaires.
  • Inhibition pharmacologique : Les cellules ont été traitées avec du tramétinib (un inhibiteur de MEK1/2) pour évaluer la sensibilité des cellules activées par YAP/TAZ et le rôle de la voie MAPK/ERK.

Contributions clés et résultats

1. Identification d'ALPK2 comme cible de YAP/TAZ : L'analyse par RNA-seq des cellules KO de LATS1/2 a révélé ALPK2 (alpha-protéine kinase 2) comme la kinase la plus significativement régulée à la hausse. La GSEA a confirmé qu'une expression élevée d'ALPK2 est fortement enrichie dans les signatures de gènes activés par YAP/TAZ dans les ensembles de données de CEB et d'adénocarcinome pulmonaire.
2. ALPK2 stimule la prolifération : L'extinction d'ALPK2 a inhibé de manière significative la prolifération cellulaire dans les lignées de CEB (WSU-HN6, CAL27) et les cellules d'adénocarcinome pulmonaire mutées pour l'EGFR (PC-9, HCC827) présentant une activation de YAP/TAZ. Cet effet a été observé à la fois dans les modèles de siRNA transitoire et de shRNA stable.
3. Dissection de la voie en aval :
   • Exclusion de PI3K/AKT : Contrairement à des rapports précédents dans les cancers de l'ovaire et du rein, la KD d'ALPK2 dans le CEB n'a pas modifié la phosphorylation d'AKT ou de S6, suggérant un mécanisme distinct en aval dans ce contexte.
   • Axe MTA2 et AP-1 : La phosphoprotéomique a identifié MTA2 (un composant du complexe NuRD) comme une protéine dont la phosphorylation est significativement réduite lors de la KD d'ALK2. La suite de l'analyse par RNA-seq et GSEA a indiqué que la KD d'ALPK2 entraînait la régulation à la baisse des gènes de la famille AP-1, spécifiquement FOSL1 (FRA-1).
   • FOSL1 comme effecteur critique : L'expression de FOSL1 a été systématiquement réduite par la KD d'ALPK2 dans toutes les lignées cellulaires testées. Des essais fonctionnels ont confirmé que la KD de FOSL1 seule a supprimé de manière significative la croissance cellulaire.
   • Connexion MAPK : Le traitement au tramétinib (inhibiteur de MEK) a réduit les niveaux de FOSL1, et les cellules KO de LATS1/2 (haut niveau de YAP/TAZ) ont montré une sensibilité accrue au tramétinib, liant l'axe ALPK2-MTA2 à la signalisation MAPK/ERK.
4. Mécanisme proposé : Les auteurs proposent un axe de régulation où l'activation de YAP/TAZ augmente la transcription d'ALPK2. ALPK2 influence ensuite l'état de phosphorylation de MTA2, qui module à son tour l'activité transcriptionnelle d'AP-1 (spécifiquement FOSL1), stimulant ainsi la prolifération tumorale.

Signification et revendications
L'étude prétend être la première à démontrer l'implication d'ALPK2 dans la progression du CEB via la voie YAP/TAZ et à suggérer un lien avec l'axe de signalisation MTA2-AP-1. Les auteurs postulent qu'ALPK2 représente une nouvelle vulnérabilité thérapeutique dans les cancers activés par YAP/TAZ.

• Potentiel thérapeutique : Puisque YAP/TAZ eux-mêmes sont difficiles à cibler directement, et que les composants de la voie Hippo en amont sont des suppresseurs de tumeurs, ALPK2 offre une cible intermédiaire prometteuse. En tant que kinase atypique possédant un domaine alpha-kinase unique, ALPK2 pourrait être amenable au développement d'inhibiteurs à petites molécules.
• Pertinence clinique : Les résultats suggèrent qu'ALPK2 pourrait servir de biomarqueur pour l'activation de YAP/TAZ et de cible pour la médecine de précision, potentiellement en combinaison avec d'autres thérapies ciblées (par exemple, les inhibiteurs d'EGFR).
• Mises en garde et limites : Les auteurs notent modestement que la relation de causalité directe entre ALPK2, MTA2 et YB-1 nécessite une vérification mécanistique supplémentaire (par exemple, via des essais de co-immunoprécipitation ou de kinase) pour confirmer la phosphorylation directe. De plus, ils reconnaissent que l'inhibition systémique d'ALPK2 comporte un risque théorique d'effets secondaires cardiaques (spécifiquement une altération de la fonction diastolique), nécessitant des stratégies de délivrance spécifiques aux tumeurs pour le développement thérapeutique futur. L'étude souligne également que le fait de savoir si YAP/TAZ se lient directement au promoteur d'ALK2 doit encore être confirmé par immunoprécipitation de la chromatine.